枯草芽孢桿菌原生質(zhì)體的制備是微生物實驗中常用的技術(shù)！
小楊 / 2025-08-25 09:18:04
枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）原生質(zhì)體制備是微生物實驗中常用的技術(shù)，核心是通過酶解去除細胞壁（主要成分為肽聚糖），獲得僅由細胞膜包裹的原生質(zhì)體，廣泛用于細胞融合、轉(zhuǎn)化、噬菌體展示等研究。其制備過程需嚴格控制菌齡、酶解條件、滲透壓等關(guān)鍵因素，具體操作機制與步驟如下：
一、制備原理
枯草芽孢桿菌為革蘭氏陽性菌，細胞壁結(jié)構(gòu)以肽聚糖為核心（占細胞壁干重的 90% 以上），無外膜結(jié)構(gòu)。原生質(zhì)體制備的核心是：
抑制細胞壁合成：通過培養(yǎng)基中添加低濃度青霉素（或選擇對數(shù)生長期后期細菌，此時細胞壁合成活躍且結(jié)構(gòu)較疏松），削弱細胞壁完整性；
酶解去除細胞壁：利用溶菌酶（專一性水解肽聚糖的 β-1,4 - 糖苷鍵）消化細胞壁，釋放原生質(zhì)體；
維持滲透壓穩(wěn)定：原生質(zhì)體無細胞壁保護，需在高滲緩沖液（如含蔗糖、山梨醇的溶液）中操作，避免因滲透吸水破裂。
二、關(guān)鍵材料準備
1、菌株與培養(yǎng)基
菌株：選擇對數(shù)生長期的
枯草芽孢桿菌（菌齡是關(guān)鍵，過老的穩(wěn)定期細菌細胞壁加厚，酶解難度大；過幼的對數(shù)早期細菌易裂解）。
培養(yǎng)基：
種子培養(yǎng)基（活化菌株）：LB 培養(yǎng)基（胰蛋白胨 10g/L、酵母提取物 5g/L、NaCl 10g/L，pH 7.0-7.2）；
菌體預處理培養(yǎng)基（誘導細胞壁疏松）：在 LB 中添加0.1-0.5 μg/mL 青霉素（對數(shù)生長期中期加入，作用 30-60 分鐘，抑制肽聚糖交聯(lián)），或使用含 2% 甘氨酸的 LB（甘氨酸可替代肽聚糖中的丙氨酸，破壞細胞壁結(jié)構(gòu)）。
2、酶與緩沖液
酶制劑：溶菌酶（純度≥80%，活力≥2000 U/mg），使用前用緩沖液配制成1-5 mg/mL 的工作液（濃度需根據(jù)菌株耐藥性調(diào)整，避免酶量過高導致原生質(zhì)體破裂）。
關(guān)鍵緩沖液（均需滅菌，pH 7.0-7.2）：
高滲懸浮緩沖液（HSM）：0.5 mol/L 蔗糖 + 20 mmol/L Tris-HCl + 10 mmol/L EDTA（EDTA 可螯合 Ca²?、Mg²?，輔助破壞細胞壁結(jié)構(gòu)，革蘭氏陽性菌可省略 EDTA，但添加后酶解效率更高）；
酶解緩沖液：在 HSM 中加入溶菌酶工作液，現(xiàn)配現(xiàn)用；
洗滌緩沖液：與 HSM 成分一致，用于酶解后清洗殘留酶液。
三、詳細操作步驟
1、菌體活化與培養(yǎng)（獲得最佳菌齡）
從斜面培養(yǎng)基挑取單菌落，接種至 50 mL LB 液體培養(yǎng)基，37℃、180-200 rpm 振蕩培養(yǎng) 12 小時（活化菌株）；
按 1% 接種量將活化菌液轉(zhuǎn)接至新鮮 LB 培養(yǎng)基（或含甘氨酸的預處理培養(yǎng)基），37℃振蕩培養(yǎng)至對數(shù)生長期后期（OD???=0.6-0.8，此時細菌繁殖活躍，細胞壁易被酶解，可通過分光光度計監(jiān)測或顯微鏡觀察：菌體呈短桿狀，無芽孢形成）；
若使用青霉素預處理：在 OD???=0.4 時加入青霉素（終濃度 0.1-0.5 μg/mL），繼續(xù)培養(yǎng) 30 分鐘，使細胞壁合成受阻。
2、菌體收集與洗滌
將培養(yǎng)好的菌液轉(zhuǎn)移至離心管，4℃、5000 rpm 離心 10 分鐘，棄上清（去除培養(yǎng)基成分）；
用預冷的高滲懸浮緩沖液（HSM）重懸菌體，輕輕吹打避免菌體破裂，重復離心洗滌 2 次（徹底去除培養(yǎng)基中的低滲成分，防止后續(xù)酶解時原生質(zhì)體吸水）。
3、酶解去除細胞壁（核心步驟）
用酶解緩沖液（含溶菌酶）重懸菌體，調(diào)整菌濃度至 OD???=1.0-1.5，轉(zhuǎn)移至錐形瓶；
37℃恒溫水?。ɑ蛘袷幣囵B(yǎng)箱）酶解，酶解時間為30-60 分鐘，期間每隔 10 分鐘取樣，通過顯微鏡觀察判斷酶解效果：
未酶解：菌體呈桿狀，邊緣清晰，革蘭氏染色陽性（紫色）；
部分酶解：菌體腫脹，邊緣模糊；
完全酶解：原生質(zhì)體呈球形，無細胞壁結(jié)構(gòu)，革蘭氏染色陰性（紅色），且在低滲溶液中（如無菌水）會迅速破裂（可通過“低滲破裂試驗”驗證：取少量酶解液滴加無菌水，顯微鏡下觀察到球形細胞消失，說明為原生質(zhì)體）。
4、原生質(zhì)體純化與保存
酶解完成后，4℃、3000 rpm 低速離心 5 分鐘（避免原生質(zhì)體破裂），棄上清（去除殘留溶菌酶）；
用預冷的洗滌緩沖液（HSM）重懸沉淀，輕輕吹打，重復離心洗滌 2 次，最終獲得純化的原生質(zhì)體懸液；
原生質(zhì)體穩(wěn)定性差，建議現(xiàn)制現(xiàn)用；若需短期保存，可加入 10%-20% 甘油，置于 - 80℃冷凍保存（解凍后需檢測存活率，存活率 =（低滲處理前活菌數(shù) - 低滲處理后活菌數(shù)）/ 低滲處理前活菌數(shù) ×100%）。
四、關(guān)鍵影響因素與優(yōu)化策略
影響因素 作用機制 優(yōu)化建議
菌齡 對數(shù)生長期后期菌體細胞壁疏松，酶解效率高；穩(wěn)定期菌體形成芽孢或細胞壁加厚 嚴格控制 OD???=0.6-0.8，避免培養(yǎng)過久
酶濃度與時間 溶菌酶濃度過低/時間過短：酶解不徹底；濃度過高/時間過長：原生質(zhì)體破裂 先進行預實驗，確定最佳條件
滲透壓 低滲環(huán)境導致原生質(zhì)體吸水破裂；高滲環(huán)境抑制活性 蔗糖濃度控制在 0.5-0.6 mol/L，所有緩沖液需滅菌，避免污染導致滲透壓變化
溫度與 pH 37℃為溶菌酶最適溫度；pH 7.0-7.2 時酶活性最高，過酸/過堿會抑制酶活 恒溫水浴嚴格控溫，緩沖液配制后用 HCl/NaOH 調(diào)節(jié) pH 至 7.0-7.2
預處理劑 青霉素抑制肽聚糖交聯(lián)，甘氨酸破壞肽聚糖結(jié)構(gòu)，提升酶解效率 革蘭氏陽性菌優(yōu)先用甘氨酸，濃度 0.5%-2%
五、常見問題與解決方案
酶解后無原生質(zhì)體形成：
原因：菌齡過老（穩(wěn)定期）、酶濃度過低、pH 不適；
解決：重新培養(yǎng)至對數(shù)生長期后期，提高酶濃度至 3-5 mg/mL，調(diào)整緩沖液 pH 至 7.0。
原生質(zhì)體存活率低（低滲試驗破裂少）：
原因：酶解時間過長、離心轉(zhuǎn)速過高（＞5000 rpm）；
解決：縮短酶解時間至 30-40 分鐘，離心轉(zhuǎn)速降至 3000 rpm，操作時輕柔吹打。
原生質(zhì)體聚集沉淀：
原因：緩沖液滲透壓不穩(wěn)定、菌體濃度過高；
解決：檢查蔗糖濃度（補加無菌蔗糖至 0.5 mol/L），稀釋原生質(zhì)體懸液至 OD???=0.5-1.0。
通過以上步驟，可高效制備高存活率的
枯草芽孢桿菌原生質(zhì)體，為后續(xù)的微生物遺傳操作（如原生質(zhì)體融合、外源基因轉(zhuǎn)化）奠定基礎(chǔ)。操作中需注意無菌環(huán)境，避免雜菌污染導致實驗失敗。
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