微生物純培養(yǎng)操作技術詳解之倒平板、劃平板與涂布！
小楊 / 2025-08-28 09:48:21
百歐博偉生物：微生物純培養(yǎng)中的三項基本操作：倒平板、劃平板和涂布。這三項技術是微生物學實驗的基石，用于分離、純化和獲得單個菌落。
一、倒平板
這是準備工作，指將融化并冷卻至一定溫度的固體培養(yǎng)基倒入無菌培養(yǎng)皿中，使其凝固形成均勻平板的過程。
目的：制備無菌的、表面光滑平整的固體培養(yǎng)基平板，為后續(xù)的接種、分離和培養(yǎng)提供支持。
關鍵步驟：
融化培養(yǎng)基：將配制好的固體培養(yǎng)基（通常裝在三角瓶或試管中）加熱融化。
冷卻：將其冷卻至45-50℃（用手觸摸三角瓶，感覺燙手但能握住幾秒鐘為宜）。這是最關鍵的一步，溫度過高會產生大量冷凝水并燙死微生物；溫度過低則培養(yǎng)基會提前凝固，無法倒出平整的平板。
倒皿：在酒精燈火焰附近的無菌區(qū)域，打開培養(yǎng)皿蓋一條小縫，迅速倒入約15-20mL培養(yǎng)基（使皿底厚度約3-4mm）。
凝固：輕輕水平晃動培養(yǎng)皿，使培養(yǎng)基均勻鋪滿皿底，然后靜置在水平桌面上，待其完全凝固。
預處理：倒置平板，放入37℃恒溫箱中孵育過夜，檢查是否有雜菌污染并蒸發(fā)掉多余冷凝水。確認無菌后方可使用。
注意事項：
無菌操作：整個過程應在酒精燈火焰附近進行，防止空氣中的雜菌落入。
溫度控制：冷卻必須到位。
厚度均勻：晃動要輕，確保平板厚度一致。
二、劃平板
又稱“平板劃線法”或“劃線分離法”，是一種用接種環(huán)對微生物樣品進行機械稀釋的方法。
目的：將混雜在一起的微生物樣品在平板表面通過劃線的方式分散開來，最終在末次劃線區(qū)域形成單個孤立的菌落，以達到分離純種的目的。
關鍵步驟（以最常用的“四分法”或“三段劃線法”為例）：
接種環(huán)滅菌：接種環(huán)在酒精燈外焰上燒紅滅菌，冷卻。
取菌：用冷卻的接種環(huán)沾取少量菌液或挑取單個菌落。
劃線：
第一區(qū)：在平板培養(yǎng)基的一側，連續(xù)劃幾條密集的、不重疊的“之”字形或平行線（約占平板面積的1/4）。此區(qū)域菌量最多。
滅菌：燒紅接種環(huán)，冷卻（關鍵?。?。
第二區(qū)：將接種環(huán)從第一區(qū)末端延伸出的菌落上劃過1-2次，然后在新區(qū)域（與第一區(qū)有少量重疊）劃出另一組線，約占另一個1/4。此時，接種環(huán)上攜帶的菌量已減少。
再次滅菌：重復滅菌接種環(huán)。
第三、四區(qū)：重復以上過程，從上一區(qū)的末端劃過，在新的空白區(qū)域劃線。每劃一個新區(qū)，菌量就被稀釋一次。
培養(yǎng)：劃線完成后，蓋上皿蓋，將平板倒置（防止冷凝水滴落沖散菌落），放入恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
注意事項：
徹底滅菌：每次劃新區(qū)前，接種環(huán)必須徹底滅菌冷卻，否則無法起到稀釋作用。
勿劃破培養(yǎng)基：用力要輕，避免劃破瓊脂表面。
區(qū)域分明：各區(qū)線之間盡量不重疊，以保證稀釋效果。
三、涂布
又稱“涂布平板法”，需要先將一定量的菌液加到平板中央，然后用一個無菌的涂布棒將其均勻地涂布到整個平板表面。
目的：
分離純化：與劃線法類似，通過將菌液均勻分散來獲得單菌落。
定量計數(shù)：這是涂布法更重要的用途。由于加入的菌液體積是已知的（如100μL），長出的菌落數(shù)可以用來推算原始菌液中的微生物濃度（CFU/mL，菌落形成單位/毫升）。
關鍵步驟：
加樣：用無菌移液器吸取一定體積（通常為0.1-0.2mL）的菌液（或經(jīng)過適當稀釋的菌液）滴加在平板培養(yǎng)基中央。
涂布：手持無菌的玻璃涂布棒（L型棒），將其一端輕輕接觸培養(yǎng)基表面使其冷卻。然后將涂布棒垂直貼在平板表面，快速而平穩(wěn)地旋轉平板，將菌液均勻地涂開，直至菌液被培養(yǎng)基完全吸收。
吸收：靜置片刻，讓菌液完全滲入培養(yǎng)基。
培養(yǎng)：倒置平板，進行培養(yǎng)。
注意事項：
涂布棒無菌：涂布棒使用前必須用酒精浸泡并在火焰上灼燒滅菌，切記要冷卻，否則會燙死微生物。
菌液量適中：加入的菌液不宜過多，否則不易涂開且不易吸收，會導致菌落連成一片。
涂布均勻：要確保菌液被涂布到整個平板表面，這樣才能長出均勻分布的菌落以便計數(shù)。
總結與對比
特性 倒平板 劃平板 涂布
主要目的 制備無菌平板 分離純化微生物 分離純化和定量計數(shù)
操作核心 傾倒培養(yǎng)基 用接種環(huán)劃線稀釋 用涂布棒涂布均勻
關鍵工具 三角瓶、培養(yǎng)皿 接種環(huán) 移液器、涂布棒
對氧需求 適用于兼性厭氧菌和需氧菌 特別適用于需氧菌（所有細胞都在表面）
菌落位置 主要在表面生長 完全在表面生長
優(yōu)點 基礎準備工作 快速、簡便、無需特殊設備 定量、菌落分布均勻
缺點 無法用于精確計數(shù) 需要額外工具（移液器、涂布棒），操作稍繁瑣
簡單來說：
倒平板是“做盤子”。
劃平板和涂布是“分菜”的方法，目的都是把一盤混合的“菜”（微生物混合物）分裝開，讓每種“菜”（純種微生物）都能獨立成盤（形成單菌落）。劃平板像用筷子撥拉，涂布像用鏟子攤平，后者還能數(shù)清楚一開始下了多少“料”（定量計數(shù)）。
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