克氏雙糖鐵瓊脂的實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)制備方法及關(guān)鍵注意事項(xiàng)！
小楊 / 2025-08-29 09:16:36
克氏雙糖鐵瓊脂（KIA）的制備需嚴(yán)格控制成分比例、pH 值、滅菌條件及斜面成型工藝，以確保其鑒別功能的準(zhǔn)確性（如糖發(fā)酵反應(yīng)、H?S 檢測(cè)的靈敏度）。以下是實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)制備方法，涵蓋“試劑準(zhǔn)備 - 配制 - 滅菌 - 分裝 - 成型”全流程，適用于批量或少量制備。
一、制備前核心準(zhǔn)備
1、關(guān)鍵試劑與規(guī)格
KIA 的成分需精準(zhǔn)稱量，尤其是葡萄糖（低濃度）與乳糖（高濃度）的比例（1:10），直接影響糖發(fā)酵結(jié)果判讀；H?S 檢測(cè)相關(guān)成分需避免氧化，建議使用新鮮試劑。具體試劑及用量（以制備 1000mL 培養(yǎng)基為例）如下表：
試劑名稱 化學(xué)純（CP）或生物試劑（BR） 用量（1000mL） 核心作用
牛肉膏 BR 3g 提供氮源、維生素、生長(zhǎng)因子，促進(jìn)細(xì)菌生長(zhǎng)
蛋白胨 BR（胰蛋白胨或大豆蛋白胨） 20g 主要氮源，提供氨基酸，支持細(xì)菌代謝
葡萄糖 BR（無(wú)水） 1g 低濃度碳源，檢測(cè)細(xì)菌對(duì)單糖的發(fā)酵能力
乳糖 BR（無(wú)水） 10g 高濃度碳源，檢測(cè)細(xì)菌對(duì)雙糖的發(fā)酵能力（與葡萄糖形成濃度差）
硫酸亞鐵銨 CP 0.2g 提供 Fe²?，與 S²?結(jié)合生成黑色 FeS 沉淀，檢測(cè) H?S
硫代硫酸鈉 CP（無(wú)水） 0.3g 提供 S²?前體，被細(xì)菌分解為 S²?，作為 H?S 的底物
酚紅指示劑 0.2% 水溶液（BR） 12.5mL pH 指示劑（pH 6.8-8.4：黃→紅），可視化糖發(fā)酵產(chǎn)酸導(dǎo)致的 pH 變化
瓊脂 BR（細(xì)菌培養(yǎng)專用） 15-20g 凝固劑，形成固體培養(yǎng)基（濃度需適中：過(guò)低易液化，過(guò)高過(guò)硬影響穿刺）
蒸餾水 無(wú)離子水或雙蒸水 1000mL 溶劑，避免雜質(zhì)（如金屬離子）干擾 H?S 反應(yīng)
2、儀器與耗材
稱量工具：電子天平（精度 0.01g）、藥匙（專用，避免交叉污染）；
溶解容器：2000mL 錐形瓶（帶刻度，便于定容）；
滅菌設(shè)備：高壓蒸汽滅菌鍋（需校準(zhǔn)溫度與壓力）；
分裝工具：15mm×150mm 玻璃試管（或一次性無(wú)菌試管）、移液管（10mL/25mL）；
輔助工具：pH 計(jì)（或精密 pH 試紙，范圍 6.0-8.0）、酒精燈、石棉網(wǎng)、磁力攪拌器（可選，加速溶解）、斜面架（或試管架，用于成型）。
3、預(yù)操作：試劑預(yù)處理
硫酸亞鐵銨易氧化（氧化后 Fe²?變?yōu)?Fe³?，影響 H?S 檢測(cè)），需在臨溶解前稱量，且避免長(zhǎng)時(shí)間暴露于空氣中；
酚紅指示劑若有沉淀，需過(guò)濾后使用（0.22μm 濾膜過(guò)濾），防止指示劑顆粒影響觀察；
瓊脂需掰成小塊（或粉末狀），避免溶解時(shí)結(jié)塊（結(jié)塊會(huì)導(dǎo)致滅菌不徹底）。
二、分步制備流程（1000mL 為例）
步驟 1：稱量與溶解（核心：先溶解可溶性成分，后加瓊脂）
溶解基礎(chǔ)營(yíng)養(yǎng)成分：向 2000mL 錐形瓶中加入 800mL 蒸餾水，依次加入牛肉膏、蛋白胨，用玻璃棒攪拌至完全溶解（可置于石棉網(wǎng)上小火加熱，加速溶解，避免糊底）；
加入糖與 H?S 相關(guān)試劑：待上述溶液冷卻至 50℃以下（避免高溫破壞葡萄糖），加入葡萄糖、乳糖、硫酸亞鐵銨、硫代硫酸鈉，繼續(xù)攪拌至完全溶解（此階段溶液應(yīng)呈淡黃色透明狀，無(wú)沉淀）；
定容與調(diào)節(jié) pH：向錐形瓶中補(bǔ)加蒸餾水至 1000mL 刻度線，用 pH 計(jì)檢測(cè)當(dāng)前 pH 值（未加瓊脂和指示劑時(shí)），需調(diào)節(jié)至7.4±0.2（若 pH 偏低，滴加 1mol/L NaOH 溶液；若 pH 偏高，滴加 1mol/L HCl 溶液，邊加邊攪拌，避免 pH 驟變）；
加入瓊脂與指示劑：加入稱量好的瓊脂，攪拌均勻后，滴加 0.2% 酚紅指示劑 12.5mL，繼續(xù)攪拌至溶液呈均勻淡紅色（此時(shí)溶液可能因瓊脂未溶解而渾濁，屬正常現(xiàn)象）。
步驟 2：滅菌（關(guān)鍵：防止糖碳化與成分分解）
KIA 含葡萄糖、乳糖等易碳化成分，需采用“低壓蒸汽滅菌”，避免高溫導(dǎo)致糖分解或顏色變深（影響結(jié)果判讀），具體參數(shù)如下：
滅菌設(shè)備：高壓蒸汽滅菌鍋（立式或臥式）；
滅菌條件：121℃、103.4kPa（1.05kg/cm²），滅菌 15 分鐘（滅菌時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致瓊脂軟化，過(guò)短則滅菌不徹底，易污染）；
滅菌后處理：滅菌結(jié)束后，立即關(guān)閉加熱，待滅菌鍋內(nèi)壓力降至 0kPa、溫度降至 100℃以下時(shí)，緩慢打開(kāi)排氣閥，取出錐形瓶（避免驟冷導(dǎo)致溶液暴沸），置于 50-60℃水浴鍋中保溫（防止瓊脂凝固，便于后續(xù)分裝）。
步驟 3：分裝（核心：控制裝量，確保“斜面 + 底層”比例）
KIA 需制成“底層高、斜面短”的柱狀形態(tài)（底層為厭氧環(huán)境，斜面為有氧環(huán)境），分裝時(shí)需注意：
試管準(zhǔn)備：將 15mm×150mm 玻璃試管洗凈、烘干，置于試管架上（每管裝量約 10-12mL，可裝 80-100 管 / 1000mL）；
分裝操作：用無(wú)菌移液管（或直接傾倒，傾倒時(shí)需在酒精燈火焰旁，避免污染）向試管內(nèi)加入培養(yǎng)基，每管液面高度約為試管長(zhǎng)度的 1/3（即 4-5cm，確保底層厚度足夠，穿刺時(shí)能達(dá)厭氧環(huán)境）；
避免污染：分裝過(guò)程中，錐形瓶瓶口始終靠近酒精燈火焰，試管口傾斜 45°，防止空氣中的雜菌落入。
步驟 4：斜面成型（決定有氧 / 厭氧環(huán)境的關(guān)鍵）
分裝后需立即制作斜面，確保瓊脂凝固后形成“底層直立、斜面平緩”的結(jié)構(gòu)：
放置試管：將分裝好的試管斜置于斜面架上，調(diào)節(jié)斜面角度，使試管底部（底層）高度約為斜面頂端高度的 2 倍（即斜面長(zhǎng)度約為試管長(zhǎng)度的 1/2，避免斜面過(guò)長(zhǎng)導(dǎo)致底層過(guò)薄，或斜面過(guò)短影響有氧生長(zhǎng)）；
凝固條件：置于室溫（25-30℃） 自然凝固（約 2-3 小時(shí)），或置于 4℃冰箱加速凝固（1 小時(shí)，需加蓋防塵罩，避免吸潮）；
禁止在高溫環(huán)境下凝固（如靠近暖氣或烘箱），否則會(huì)導(dǎo)致水分蒸發(fā)過(guò)多，瓊脂干裂，影響細(xì)菌生長(zhǎng)；
檢查成型質(zhì)量：凝固后，斜面應(yīng)平整、無(wú)氣泡、無(wú)裂痕，底層無(wú)分層，整體顏色為均勻淡紅色（若顏色偏深或偏黃，可能是 pH 異常或滅菌過(guò)度，需丟棄）。
步驟 5：滅菌后驗(yàn)證與儲(chǔ)存
無(wú)菌性驗(yàn)證：隨機(jī)抽取 3-5 管制備好的 KIA，置于 37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 24 小時(shí)，若培養(yǎng)基表面無(wú)雜菌生長(zhǎng)（無(wú)霉斑、渾濁、菌落），則無(wú)菌性合格；若有污染，需整批重新制備；
大腸埃希菌應(yīng)呈“A/A，產(chǎn)氣 ±，H?S-”；
沙門氏菌應(yīng)呈“K/A，產(chǎn)氣 +，H?S+”；
若結(jié)果符合預(yù)期，說(shuō)明培養(yǎng)基性能合格；
儲(chǔ)存條件：合格的 KIA 需密封（試管口用 parafilm 纏繞，或放入密封袋），置于 4℃冰箱儲(chǔ)存，有效期為1 個(gè)月（儲(chǔ)存過(guò)久易吸潮，導(dǎo)致瓊脂軟化或成分降解，影響結(jié)果）；使用前需提前 1 小時(shí)取出，恢復(fù)至室溫。
三、制備關(guān)鍵注意事項(xiàng)（避免結(jié)果誤差）
pH 值精準(zhǔn)控制：最終培養(yǎng)基 pH 必須為 7.4±0.2（未滅菌前調(diào)節(jié)），若 pH 偏低（<7.2），未接種時(shí)可能已呈黃色，導(dǎo)致誤判；若 pH 偏高（>7.6），糖發(fā)酵產(chǎn)酸后可能無(wú)法使指示劑變黃，掩蓋陽(yáng)性反應(yīng)；
硫酸亞鐵銨與硫代硫酸鈉的添加順序：需在基礎(chǔ)營(yíng)養(yǎng)成分溶解后、瓊脂加入前添加，避免與高溫瓊脂直接接觸（高溫可能導(dǎo)致 Fe²?氧化，降低 H?S 檢測(cè)靈敏度）；
滅菌時(shí)間與溫度：嚴(yán)格遵循 121℃、15 分鐘，不可延長(zhǎng)滅菌時(shí)間（如 20 分鐘），否則葡萄糖、乳糖會(huì)碳化（溶液呈褐色），影響顏色觀察；
斜面成型角度：斜面長(zhǎng)度不可超過(guò)試管長(zhǎng)度的 1/2，否則底層厚度不足（<3cm），穿刺時(shí)無(wú)法達(dá)到厭氧環(huán)境，導(dǎo)致底層反應(yīng)（如產(chǎn)氣、H?S）不明顯；
避免反復(fù)加熱：滅菌后的培養(yǎng)基若未及時(shí)分裝凝固，可在 50-60℃水浴中保溫 1-2 小時(shí)，但不可反復(fù)加熱（超過(guò) 2 次），否則瓊脂會(huì)降解（失去凝固能力），且成分會(huì)破壞。
通過(guò)以上標(biāo)準(zhǔn)化制備流程，可確保
KIA 的物理性狀（凝固度、顏色）和生化性能（糖發(fā)酵、H?S 檢測(cè)）符合要求，為腸桿菌科細(xì)菌的鑒別提供可靠的培養(yǎng)基基礎(chǔ)。
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