微生物實(shí)驗(yàn)室常規(guī)檢測(cè)之負(fù)染色法的操作步驟及注意事項(xiàng)！
小楊 / 2025-09-02 09:03:00
百歐博偉生物：負(fù)染色法是細(xì)菌莢膜染色中最常用的技術(shù)之一，其核心原理是利用菌體與背景著色、莢膜不著色的對(duì)比效果，清晰呈現(xiàn)莢膜的無色透明圈結(jié)構(gòu)（莢膜因與染料親和力弱，無法被染色，而菌體和背景分別被不同染料著色，形成“負(fù)向”對(duì)比）。以下是負(fù)染色法的詳細(xì)操作步驟、關(guān)鍵注意事項(xiàng)及結(jié)果判讀，適用于微生物實(shí)驗(yàn)室常規(guī)檢測(cè)。
一、實(shí)驗(yàn)原理回顧
負(fù)染色法通過兩種染料的協(xié)同作用實(shí)現(xiàn)對(duì)比：
復(fù)紅染色液：作為堿性染料，可與菌體表面的酸性基團(tuán)結(jié)合，使菌體被染成紅色。
黑素（或印度墨汁）：作為負(fù)染劑，不與菌體和莢膜反應(yīng)，僅附著于載玻片背景，使背景呈灰色或黑色。
最終鏡檢時(shí)，無色透明的莢膜會(huì)在“紅色菌體”與“灰色背景”之間形成清晰的反差圈，便于觀察。
二、實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備
在操作前需確認(rèn)所有器材和試劑就緒，避免操作中斷影響染色效果。
1、器材準(zhǔn)備
潔凈載玻片（無劃痕、無油污，可提前用酒精擦拭后烘干）；
接種環(huán)（需滅菌，使用前在酒精燈外焰灼燒至紅熱，冷卻后使用）；
酒精燈（用于滅菌和干燥，注意安全）；
吸水紙（質(zhì)地柔軟，避免刮擦涂片）；
光學(xué)顯微鏡（配備油鏡，用于觀察細(xì)菌細(xì)節(jié)）；
蒸餾水（用于稀釋菌液，確保濃度適宜）。
2、試劑準(zhǔn)備
復(fù)紅染色液：常用 0.5%-1% 的堿性復(fù)紅水溶液，染色能力強(qiáng)，可快速使菌體著色；
黑素溶液：濃度約 5%-10%，需過濾去除雜質(zhì)（避免背景出現(xiàn)顆粒影響觀察），也可用印度墨汁替代（效果類似）。
3、樣品準(zhǔn)備
選取含莢膜的細(xì)菌培養(yǎng)物（如
肺炎鏈球菌、
流感嗜血桿菌等，需處于對(duì)數(shù)生長期，莢膜結(jié)構(gòu)完整）；
若為固體培養(yǎng)基培養(yǎng)的細(xì)菌，需挑取少量菌落；若為液體培養(yǎng)基，直接取少量菌液即可。
三、詳細(xì)操作步驟（分 6 步，按順序執(zhí)行）
步驟 1：制備菌液涂片
取一張潔凈載玻片，在中央滴加1 小滴蒸餾水（約 5-10μL，量不宜過多，避免后續(xù)干燥困難）；
用滅菌冷卻后的接種環(huán)，挑取少量待檢細(xì)菌（固體培養(yǎng)物取“針尖大小”即可，液體培養(yǎng)物取 1-2 環(huán)），放入蒸餾水滴中；
輕輕研磨接種環(huán)，使細(xì)菌與蒸餾水充分混勻，形成均勻的菌懸液（濃度以“透過涂片能看清載玻片上的字跡”為宜，過濃會(huì)導(dǎo)致菌體堆積，無法觀察莢膜；過稀則難以找到菌體）；
用接種環(huán)將菌懸液在載玻片上輕輕涂布成直徑約 1-2cm 的薄層（涂布時(shí)力度要輕，避免破壞莢膜結(jié)構(gòu)）。
步驟 2：涂片干燥（關(guān)鍵：避免加熱，需自然干燥）
將涂布好的載玻片平放在實(shí)驗(yàn)臺(tái)上，自然晾干（約 5-10 分鐘，具體時(shí)間取決于環(huán)境濕度，以涂片完全干燥、無濕潤感為準(zhǔn)）；
若需加速干燥，可使用電吹風(fēng)吹冷風(fēng)（距離載玻片 10-15cm，避免熱風(fēng)，高溫會(huì)破壞莢膜的多糖結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致染色失?。?；
嚴(yán)禁將涂片放在酒精燈上烘烤干燥！加熱會(huì)使菌體收縮、莢膜變形或脫落，無法觀察真實(shí)結(jié)構(gòu)。
步驟 3：菌體染色（復(fù)紅染色）
待涂片完全干燥后，用滴管吸取復(fù)紅染色液，均勻覆蓋整個(gè)菌膜區(qū)域（確保染色液完全浸沒涂片，避免局部未染色）；
室溫下染色2-3 分鐘（染色時(shí)間不宜過長，否則背景可能被復(fù)紅輕微著色，影響對(duì)比；也不宜過短，否則菌體著色不深）；
染色結(jié)束后，手持載玻片邊緣，將其傾斜 45°，用緩慢流動(dòng)的自來水輕輕沖洗涂片（水流不宜過急，避免沖掉菌體或破壞莢膜），直至流出的水呈無色透明為止；
用吸水紙輕輕吸去涂片表面的水分（注意：吸水紙僅“蘸取”水分，不可用力擦拭，以免刮掉涂片），然后再次將載玻片平放，自然晾干（或冷風(fēng)烘干）。
步驟 4：背景負(fù)染（黑素染色）
待復(fù)紅染色后的涂片完全干燥后，在涂片的左側(cè)邊緣滴加1 小滴黑素溶液（約 3-5μL，量不宜過多，避免溢出）；
取另一張潔凈、邊緣光滑的載玻片（作為“推片”），將其邊緣輕輕接觸黑素液滴，使黑素沿推片邊緣均勻散開（此時(shí)推片與載玻片的夾角約 15°-30°）；
以平穩(wěn)、快速的速度將推片向右拖動(dòng)，使黑素在菌膜區(qū)域形成一層均勻的薄層（類似制作血涂片的推片動(dòng)作，目的是讓黑素覆蓋整個(gè)菌膜，且厚度適宜 —— 過厚會(huì)導(dǎo)致背景過黑，看不清莢膜；過薄則背景顏色過淺，對(duì)比不明顯）；
立即將載玻片平放在實(shí)驗(yàn)臺(tái)上，迅速風(fēng)干黑素層（黑素干燥速度較快，約 1-2 分鐘，避免長時(shí)間放置導(dǎo)致黑素堆積）。
步驟 5：顯微鏡觀察（油鏡觀察，需按順序調(diào)焦）
先將染色好的載玻片放在顯微鏡載物臺(tái)上，用低倍鏡（10× 物鏡）找到涂片區(qū)域，調(diào)節(jié)粗準(zhǔn)焦螺旋使視野清晰；
轉(zhuǎn)換到高倍鏡（40× 物鏡），進(jìn)一步定位到菌體分布較均勻的區(qū)域（避免選擇菌體堆積或空白區(qū)域）；
滴加 1 滴香柏油于目標(biāo)區(qū)域，轉(zhuǎn)換到油鏡（100× 物鏡），緩慢調(diào)節(jié)細(xì)準(zhǔn)焦螺旋（油鏡下嚴(yán)禁使用粗準(zhǔn)焦螺旋，避免壓壞載玻片或損壞鏡頭），直至視野清晰。
步驟 6：結(jié)果判讀
在油鏡下觀察，典型結(jié)果如下：
背景：被黑素染成灰色或淺黑色，無明顯顆粒；
菌體：被復(fù)紅染成鮮紅色，形態(tài)清晰（如球菌呈圓形，桿菌呈桿狀）；
莢膜：位于菌體周圍，呈無色透明的圈狀結(jié)構(gòu)（寬度因細(xì)菌種類而異，如
肺炎鏈球菌的莢膜較厚，
流感嗜血桿菌的莢膜較薄），與紅色菌體和灰色背景形成鮮明對(duì)比。
四、關(guān)鍵注意事項(xiàng)（避免染色失敗的核心要點(diǎn)）
莢膜保護(hù)：莢膜主要成分為多糖，對(duì)溫度、機(jī)械力敏感，操作中需避免加熱（如烘烤干燥）、用力涂布或沖洗，否則會(huì)導(dǎo)致莢膜脫落，無法觀察。
菌液濃度控制：菌液過濃會(huì)導(dǎo)致菌體堆積，莢膜相互重疊；過稀則難以找到菌體，需嚴(yán)格控制“能看清載玻片字跡”的濃度。
黑素薄層制備：推片時(shí)速度要平穩(wěn)、快速，若速度過慢，黑素會(huì)堆積成塊；速度過快則黑素層過薄，背景顏色不足，需多次練習(xí)掌握力度。
染色時(shí)間：復(fù)紅染色 2-3 分鐘即可，過長會(huì)導(dǎo)致背景泛紅；黑素?zé)o需額外染色，僅需形成薄層即可。
顯微鏡操作：油鏡觀察前需確保涂片完全干燥，且香柏油滴加適量（過多會(huì)溢出污染鏡頭，過少則無法形成油浸系統(tǒng)，視野模糊）。
五、常見問題與解決方案
常見問題 可能原因 解決方案
看不到莢膜 加熱干燥破壞莢膜；菌齡過長 嚴(yán)格自然干燥或冷風(fēng)干燥；選用對(duì)數(shù)期菌培養(yǎng)物
背景顆粒多 黑素未過濾，含雜質(zhì) 染色前用濾紙過濾黑素溶液
菌體著色淺 復(fù)紅染色時(shí)間不足；或涂片未干燥就染色 延長復(fù)紅染色至 2-3 分鐘；確保涂片完全干燥
菌體堆積，看不清細(xì)節(jié) 菌液濃度過高 增加蒸餾水用量，稀釋菌液后重新涂布
通過以上步驟和注意事項(xiàng)，可高效完成莢膜負(fù)染色，清晰觀察到細(xì)菌莢膜的形態(tài)特征，為細(xì)菌鑒定（如區(qū)分有莢膜與無莢膜菌株）提供重要依據(jù)。
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