微生物實驗室常規(guī)檢測之負染色法的操作步驟及注意事項！
小楊 / 2025-09-02 09:03:00
百歐博偉生物：負染色法是細菌莢膜染色中最常用的技術(shù)之一，其核心原理是利用菌體與背景著色、莢膜不著色的對比效果，清晰呈現(xiàn)莢膜的無色透明圈結(jié)構(gòu)（莢膜因與染料親和力弱，無法被染色，而菌體和背景分別被不同染料著色，形成“負向”對比）。以下是負染色法的詳細操作步驟、關(guān)鍵注意事項及結(jié)果判讀，適用于微生物實驗室常規(guī)檢測。
一、實驗原理回顧
負染色法通過兩種染料的協(xié)同作用實現(xiàn)對比：
復(fù)紅染色液：作為堿性染料，可與菌體表面的酸性基團結(jié)合，使菌體被染成紅色。
黑素（或印度墨汁）：作為負染劑，不與菌體和莢膜反應(yīng)，僅附著于載玻片背景，使背景呈灰色或黑色。
最終鏡檢時，無色透明的莢膜會在“紅色菌體”與“灰色背景”之間形成清晰的反差圈，便于觀察。
二、實驗準備
在操作前需確認所有器材和試劑就緒，避免操作中斷影響染色效果。
1、器材準備
潔凈載玻片（無劃痕、無油污，可提前用酒精擦拭后烘干）；
接種環(huán)（需滅菌，使用前在酒精燈外焰灼燒至紅熱，冷卻后使用）；
酒精燈（用于滅菌和干燥，注意安全）；
吸水紙（質(zhì)地柔軟，避免刮擦涂片）；
光學(xué)顯微鏡（配備油鏡，用于觀察細菌細節(jié)）；
蒸餾水（用于稀釋菌液，確保濃度適宜）。
2、試劑準備
復(fù)紅染色液：常用 0.5%-1% 的堿性復(fù)紅水溶液，染色能力強，可快速使菌體著色；
黑素溶液：濃度約 5%-10%，需過濾去除雜質(zhì)（避免背景出現(xiàn)顆粒影響觀察），也可用印度墨汁替代（效果類似）。
3、樣品準備
選取含莢膜的細菌培養(yǎng)物（如
肺炎鏈球菌、
流感嗜血桿菌等，需處于對數(shù)生長期，莢膜結(jié)構(gòu)完整）；
若為固體培養(yǎng)基培養(yǎng)的細菌，需挑取少量菌落；若為液體培養(yǎng)基，直接取少量菌液即可。
三、詳細操作步驟（分 6 步，按順序執(zhí)行）
步驟 1：制備菌液涂片
取一張潔凈載玻片，在中央滴加1 小滴蒸餾水（約 5-10μL，量不宜過多，避免后續(xù)干燥困難）；
用滅菌冷卻后的接種環(huán)，挑取少量待檢細菌（固體培養(yǎng)物取“針尖大小”即可，液體培養(yǎng)物取 1-2 環(huán)），放入蒸餾水滴中；
輕輕研磨接種環(huán)，使細菌與蒸餾水充分混勻，形成均勻的菌懸液（濃度以“透過涂片能看清載玻片上的字跡”為宜，過濃會導(dǎo)致菌體堆積，無法觀察莢膜；過稀則難以找到菌體）；
用接種環(huán)將菌懸液在載玻片上輕輕涂布成直徑約 1-2cm 的薄層（涂布時力度要輕，避免破壞莢膜結(jié)構(gòu)）。
步驟 2：涂片干燥（關(guān)鍵：避免加熱，需自然干燥）
將涂布好的載玻片平放在實驗臺上，自然晾干（約 5-10 分鐘，具體時間取決于環(huán)境濕度，以涂片完全干燥、無濕潤感為準）；
若需加速干燥，可使用電吹風吹冷風（距離載玻片 10-15cm，避免熱風，高溫會破壞莢膜的多糖結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致染色失敗）；
嚴禁將涂片放在酒精燈上烘烤干燥！加熱會使菌體收縮、莢膜變形或脫落，無法觀察真實結(jié)構(gòu)。
步驟 3：菌體染色（復(fù)紅染色）
待涂片完全干燥后，用滴管吸取復(fù)紅染色液，均勻覆蓋整個菌膜區(qū)域（確保染色液完全浸沒涂片，避免局部未染色）；
室溫下染色2-3 分鐘（染色時間不宜過長，否則背景可能被復(fù)紅輕微著色，影響對比；也不宜過短，否則菌體著色不深）；
染色結(jié)束后，手持載玻片邊緣，將其傾斜 45°，用緩慢流動的自來水輕輕沖洗涂片（水流不宜過急，避免沖掉菌體或破壞莢膜），直至流出的水呈無色透明為止；
用吸水紙輕輕吸去涂片表面的水分（注意：吸水紙僅“蘸取”水分，不可用力擦拭，以免刮掉涂片），然后再次將載玻片平放，自然晾干（或冷風烘干）。
步驟 4：背景負染（黑素染色）
待復(fù)紅染色后的涂片完全干燥后，在涂片的左側(cè)邊緣滴加1 小滴黑素溶液（約 3-5μL，量不宜過多，避免溢出）；
取另一張潔凈、邊緣光滑的載玻片（作為“推片”），將其邊緣輕輕接觸黑素液滴，使黑素沿推片邊緣均勻散開（此時推片與載玻片的夾角約 15°-30°）；
以平穩(wěn)、快速的速度將推片向右拖動，使黑素在菌膜區(qū)域形成一層均勻的薄層（類似制作血涂片的推片動作，目的是讓黑素覆蓋整個菌膜，且厚度適宜 —— 過厚會導(dǎo)致背景過黑，看不清莢膜；過薄則背景顏色過淺，對比不明顯）；
立即將載玻片平放在實驗臺上，迅速風干黑素層（黑素干燥速度較快，約 1-2 分鐘，避免長時間放置導(dǎo)致黑素堆積）。
步驟 5：顯微鏡觀察（油鏡觀察，需按順序調(diào)焦）
先將染色好的載玻片放在顯微鏡載物臺上，用低倍鏡（10× 物鏡）找到涂片區(qū)域，調(diào)節(jié)粗準焦螺旋使視野清晰；
轉(zhuǎn)換到高倍鏡（40× 物鏡），進一步定位到菌體分布較均勻的區(qū)域（避免選擇菌體堆積或空白區(qū)域）；
滴加 1 滴香柏油于目標區(qū)域，轉(zhuǎn)換到油鏡（100× 物鏡），緩慢調(diào)節(jié)細準焦螺旋（油鏡下嚴禁使用粗準焦螺旋，避免壓壞載玻片或損壞鏡頭），直至視野清晰。
步驟 6：結(jié)果判讀
在油鏡下觀察，典型結(jié)果如下：
背景：被黑素染成灰色或淺黑色，無明顯顆粒；
菌體：被復(fù)紅染成鮮紅色，形態(tài)清晰（如球菌呈圓形，桿菌呈桿狀）；
莢膜：位于菌體周圍，呈無色透明的圈狀結(jié)構(gòu)（寬度因細菌種類而異，如
肺炎鏈球菌的莢膜較厚，
流感嗜血桿菌的莢膜較薄），與紅色菌體和灰色背景形成鮮明對比。
四、關(guān)鍵注意事項（避免染色失敗的核心要點）
莢膜保護：莢膜主要成分為多糖，對溫度、機械力敏感，操作中需避免加熱（如烘烤干燥）、用力涂布或沖洗，否則會導(dǎo)致莢膜脫落，無法觀察。
菌液濃度控制：菌液過濃會導(dǎo)致菌體堆積，莢膜相互重疊；過稀則難以找到菌體，需嚴格控制“能看清載玻片字跡”的濃度。
黑素薄層制備：推片時速度要平穩(wěn)、快速，若速度過慢，黑素會堆積成塊；速度過快則黑素層過薄，背景顏色不足，需多次練習掌握力度。
染色時間：復(fù)紅染色 2-3 分鐘即可，過長會導(dǎo)致背景泛紅；黑素無需額外染色，僅需形成薄層即可。
顯微鏡操作：油鏡觀察前需確保涂片完全干燥，且香柏油滴加適量（過多會溢出污染鏡頭，過少則無法形成油浸系統(tǒng)，視野模糊）。
五、常見問題與解決方案
常見問題 可能原因 解決方案
看不到莢膜 加熱干燥破壞莢膜；菌齡過長 嚴格自然干燥或冷風干燥；選用對數(shù)期菌培養(yǎng)物
背景顆粒多 黑素未過濾，含雜質(zhì) 染色前用濾紙過濾黑素溶液
菌體著色淺 復(fù)紅染色時間不足；或涂片未干燥就染色 延長復(fù)紅染色至 2-3 分鐘；確保涂片完全干燥
菌體堆積，看不清細節(jié) 菌液濃度過高 增加蒸餾水用量，稀釋菌液后重新涂布
通過以上步驟和注意事項，可高效完成莢膜負染色，清晰觀察到細菌莢膜的形態(tài)特征，為細菌鑒定（如區(qū)分有莢膜與無莢膜菌株）提供重要依據(jù)。
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