厭氧菌瓊脂培養(yǎng)結(jié)果中出現(xiàn)雜菌污染的處理方法與操作流程！
小楊 / 2025-09-05 10:00:53
百歐博偉生物：當(dāng)
厭氧菌瓊脂培養(yǎng)結(jié)果中出現(xiàn)雜菌污染時(shí)，需通過溯源污染原因、優(yōu)化操作流程、重新分離純化等步驟處理，以獲得可靠的目標(biāo)厭氧菌。以下是具體處理方法：
一、快速判斷污染類型與來源
首先明確污染菌的性質(zhì)（需氧菌、兼性厭氧菌或其他厭氧菌），結(jié)合操作環(huán)節(jié)追溯原因：
1、污染菌的初步鑒別
通過革蘭染色、菌落形態(tài)（如
大腸桿菌為灰白色濕潤(rùn)菌落，
葡萄球菌為圓形凸起菌落）和需氧性試驗(yàn)（將可疑菌落接種于需氧 / 厭氧環(huán)境，觀察生長(zhǎng)情況），判斷是需氧菌（如
銅綠假單胞菌）、兼性厭氧菌（如
腸球菌）還是其他非目標(biāo)厭氧菌（如污染的梭菌）。
若污染菌為需氧菌，提示厭氧環(huán)境失效（如密封不嚴(yán)）或樣本采集時(shí)混入空氣；若為兼性厭氧菌，可能因樣本本身含大量雜菌（如糞便樣本未稀釋）或操作時(shí)未嚴(yán)格無菌；若為其他厭氧菌，可能是樣本中正常菌群污染（如口腔樣本混入唾液中的放線菌）。
2、追溯污染環(huán)節(jié)
樣本采集：是否使用無菌容器？是否避免了體表正常菌群污染（如糞便樣本是否取深部糞便，傷口樣本是否先清創(chuàng)）？
接種操作：是否在厭氧工作站或超凈臺(tái)內(nèi)進(jìn)行？接種環(huán)是否徹底滅菌？
培養(yǎng)環(huán)境：厭氧罐是否密封？產(chǎn)氣包是否失效？指示劑是否提示有氧滲入？
培養(yǎng)基：是否過期？是否被開封后污染？
二、針對(duì)性處理污染，重新分離培養(yǎng)
根據(jù)污染原因采取措施，確保二次培養(yǎng)無雜菌：
1、優(yōu)化樣本采集與預(yù)處理
對(duì)含大量雜菌的樣本（如糞便、痰液），采用稀釋法（10 倍梯度稀釋至 10??）或選擇性富集（如用含萬古霉素、卡那霉素的液體培養(yǎng)基預(yù)處理，抑制革蘭氏陽性需氧菌），減少雜菌數(shù)量后再接種。
嚴(yán)格無菌操作：采集深部樣本（如膿腫穿刺液需避開皮膚表面），使用厭氧采樣管（內(nèi)含還原劑，維持樣本無氧狀態(tài)）。
2、強(qiáng)化厭氧環(huán)境控制
若因厭氧環(huán)境失效導(dǎo)致需氧菌污染：
更換新的產(chǎn)氣包（確保按體積添加，如 2.5L 厭氧罐用 1 包產(chǎn)氣包），檢查厭氧罐密封圈是否破損，擰緊蓋子時(shí)確保“密封卡扣”到位。
改用厭氧工作站操作，全程維持 < 1% 氧濃度，避免手動(dòng)開合厭氧罐導(dǎo)致的氧氣滲入。
重新放置無氧指示劑和需氧菌陰性對(duì)照（如
銅綠假單胞菌），確認(rèn)環(huán)境達(dá)標(biāo)后再接種。
3、使用選擇性培養(yǎng)基抑制雜菌
根據(jù)目標(biāo)厭氧菌的類型，選擇含特異性抑制劑的培養(yǎng)基：
分離革蘭氏陰性厭氧菌（如
擬桿菌）：用含萬古霉素（抑制革蘭氏陽性菌）的擬桿菌瓊脂。
分離革蘭氏陽性厭氧菌（如
梭菌）：用含卡那霉素（抑制革蘭氏陰性菌）的梭菌瓊脂。
若污染菌為兼性厭氧菌（如
大腸桿菌），可在培養(yǎng)基中添加刃天青（有氧時(shí)抑制兼性菌生長(zhǎng)，無氧時(shí)失效），僅允許嚴(yán)格厭氧菌生長(zhǎng)。
4、純化目標(biāo)菌落
若平板上目標(biāo)菌與雜菌共存，用接種環(huán)挑取單個(gè)可疑目標(biāo)菌落（根據(jù)形態(tài)、溶血特征判斷），在新的厭氧菌瓊脂上進(jìn)行連續(xù)劃線純化（至少 3 次），每次劃線后培養(yǎng) 48-72 小時(shí)，直至平板上僅出現(xiàn)單一形態(tài)的菌落。
純化后，通過革蘭染色、生化試驗(yàn)（如糖發(fā)酵、吲哚試驗(yàn)）確認(rèn)是否為目標(biāo)厭氧菌，排除雜菌殘留。
三、記錄與驗(yàn)證，避免再次污染
1、詳細(xì)記錄污染情況
記錄污染菌的形態(tài)、染色特性、需氧性，以及操作環(huán)節(jié)（如采樣時(shí)間、厭氧罐使用次數(shù)），便于追溯重復(fù)污染的原因（如某批次產(chǎn)氣包失效、采樣管滅菌不徹底）。
2、二次驗(yàn)證可靠性
純化后的菌落需進(jìn)行需氧 / 厭氧生長(zhǎng)試驗(yàn)：接種于兩個(gè)平板，分別在有氧和無氧環(huán)境中培養(yǎng)。若僅在無氧環(huán)境中生長(zhǎng)，確認(rèn)是厭氧菌；若有氧環(huán)境中也生長(zhǎng)，說明仍有兼性厭氧菌污染，需重新純化。
必要時(shí)通過 16S rRNA 測(cè)序確認(rèn)菌種，確保最終獲得純培養(yǎng)的目標(biāo)厭氧菌。
四、總結(jié)
處理
厭氧菌瓊脂的雜菌污染，核心是“溯源 - 控制 - 純化”：先通過對(duì)照試驗(yàn)和污染菌特性判斷污染來源（環(huán)境、樣本或操作），再針對(duì)性優(yōu)化厭氧環(huán)境、使用選擇性培養(yǎng)基，最后通過連續(xù)劃線和鑒定獲得純培養(yǎng)。嚴(yán)格遵循無菌操作和厭氧菌培養(yǎng)規(guī)范，可最大限度減少污染，保證結(jié)果可靠。
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