細(xì)菌芽孢染色法的準(zhǔn)備工作與核心步驟及操作流程與注意事項(xiàng)！
小楊 / 2025-09-11 09:58:27
百歐博偉生物：細(xì)菌芽孢染色法的成功與否，很大程度上取決于操作細(xì)節(jié)的把控。由于芽孢結(jié)構(gòu)特殊（壁厚、通透性低），且染色過(guò)程涉及加熱等關(guān)鍵步驟，任何環(huán)節(jié)的疏漏都可能導(dǎo)致染色失敗或結(jié)果誤判。以下是詳細(xì)的注意事項(xiàng)：
一、樣本與培養(yǎng)物準(zhǔn)備
1、選擇合適的培養(yǎng)物齡
芽孢是細(xì)菌在不良環(huán)境下形成的休眠體，多在老齡培養(yǎng)物中大量產(chǎn)生（如
芽孢桿菌屬培養(yǎng) 24-48 小時(shí)，
梭菌屬需厭氧培養(yǎng) 3-5 天）。
避免使用幼齡菌（培養(yǎng)時(shí)間過(guò)短，芽孢未形成）或過(guò)度老化菌（芽孢可能脫落，僅見(jiàn)游離芽孢，難以觀察與菌體的關(guān)系）。
2、確保樣本中含芽孢
若為未知菌，需先通過(guò)普通染色（如革蘭染色）初步判斷是否可能形成芽孢（
芽孢桿菌屬、
梭菌屬多為革蘭陽(yáng)性菌），再進(jìn)行芽孢染色，避免無(wú)效操作。
涂片時(shí)取菌量適中，過(guò)多易導(dǎo)致細(xì)胞堆積，影響觀察；過(guò)少則可能找不到芽孢。
二、涂片與固定
1、涂片均勻
用接種環(huán)取少量菌苔，與載玻片上的生理鹽水（或蒸餾水）充分混勻，涂成薄而均勻的菌膜（面積約 1cm²），避免菌液過(guò)濃導(dǎo)致干燥后形成團(tuán)塊。
若直接取固體培養(yǎng)基上的菌，可省略生理鹽水，直接用接種環(huán)蘸取少量菌在載玻片上涂開(kāi)（因菌本身含少量水分）。
2、固定方式正確
待菌膜自然干燥后，通過(guò)火焰固定：將載玻片快速通過(guò)酒精燈外焰 3-4 次（以手背接觸玻片不燙為宜），目的是殺死細(xì)菌、使菌體黏附在玻片上，同時(shí)避免高溫破壞芽孢結(jié)構(gòu)。
禁止在菌膜未干燥時(shí)直接加熱，否則會(huì)導(dǎo)致菌體變形、脫落。
三、初染與加熱控制（核心步驟）
1、染液選擇與用量
常用初染液為5% 孔雀綠水溶液（穿透力強(qiáng)，與芽孢結(jié)合穩(wěn)定），用量以覆蓋菌膜為宜，過(guò)多易流淌，過(guò)少則易干涸。
2、加熱溫度與時(shí)間
加熱是芽孢染色的關(guān)鍵：將載玻片放在石棉網(wǎng)上，用酒精燈外焰間接加熱，使染液保持微沸狀態(tài)（邊緣輕微冒泡），持續(xù) 5-10 分鐘。
嚴(yán)禁直接將玻片放在火焰上燒，或讓染液劇烈沸騰（高溫會(huì)破壞芽孢和菌體形態(tài)）。
加熱過(guò)程中需不斷補(bǔ)充染液（用滴管沿玻片邊緣滴加），絕對(duì)避免菌膜干涸（干涸會(huì)導(dǎo)致染料沉淀，形成顆粒狀雜質(zhì)，干擾觀察）。
3、冷卻后再處理
加熱結(jié)束后，先移去酒精燈，待玻片自然冷卻至室溫后再水洗，避免高溫下突然水洗導(dǎo)致玻片炸裂。
四、脫色與復(fù)染
1、脫色充分但不過(guò)度
用自來(lái)水緩慢沖洗（水流不宜過(guò)急，避免沖掉菌膜），直至流出的水無(wú)色（約 1-2 分鐘）。
脫色不足：營(yíng)養(yǎng)體上殘留初染液顏色，與芽孢顏色混淆，無(wú)法區(qū)分；
脫色過(guò)度：一般不會(huì)影響芽孢（因芽孢與染料結(jié)合牢固），但需注意水流強(qiáng)度，防止菌體被沖掉。
2、復(fù)染時(shí)間適中
復(fù)染目的是使?fàn)I養(yǎng)體著色，常用0.5% 番紅水溶液（或沙黃染液），染色時(shí)間 1-2 分鐘即可。
復(fù)染時(shí)間過(guò)長(zhǎng)：可能導(dǎo)致芽孢也被輕微復(fù)染，顏色對(duì)比度下降；
復(fù)染時(shí)間過(guò)短：營(yíng)養(yǎng)體著色淺，與背景區(qū)分不明顯。
五、水洗與干燥
1、水洗方向正確
水洗時(shí)應(yīng)將玻片傾斜，讓水流從玻片上方緩緩流過(guò)菌膜，避免垂直沖洗（沖擊力過(guò)強(qiáng)）。
水洗后用吸水紙輕輕吸干（或讓其自然干燥），禁止用力擦拭（防止擦掉菌膜）。
2、避免使用濾紙直接按壓
若用吸水紙，應(yīng)從邊緣吸去水分，而非直接覆蓋在菌膜上按壓，防止染料顆粒殘留或菌膜脫落。
六、鏡檢操作
1、物鏡選擇
先用低倍鏡（10×）找到菌膜區(qū)域，再換高倍鏡（40×）定位，最后用油鏡（100×）觀察細(xì)節(jié)（芽孢體積小，需油鏡才能清晰分辨形態(tài)）。
2、區(qū)分芽孢與雜質(zhì)
芽孢呈圓形或橢圓形，顏色均勻（如孔雀綠染色呈綠色），位于菌體內(nèi)部（中央、頂端或近端）或游離于菌體之外；
染料沉淀常為不規(guī)則顆粒，顏色深淺不一，可通過(guò)調(diào)整焦距區(qū)分（芽孢在不同焦距下形態(tài)穩(wěn)定，雜質(zhì)易模糊）。
3、記錄與判斷
觀察時(shí)需記錄芽孢的形態(tài)（圓形 / 橢圓形）、大?。ㄊ欠翊笥诰w直徑）、位置（如
破傷風(fēng)梭菌芽孢位于頂端，呈“鼓槌狀”），這些特征是細(xì)菌鑒定的重要依據(jù)。
七、安全與試劑管理
1、加熱安全
加熱時(shí)戴手套，避免染液濺到皮膚（孔雀綠為堿性染料，可能刺激皮膚）；使用三腳架或石棉網(wǎng)，防止玻片滑落。
2、試劑保存
孔雀綠染液需密封保存，避免蒸發(fā)濃縮；復(fù)染液易受光影響，需避光保存，定期更換（出現(xiàn)沉淀時(shí)不可使用）。
通過(guò)嚴(yán)格把控以上細(xì)節(jié)，可確保芽孢染色結(jié)果清晰：芽孢呈初染液顏色（如綠色），營(yíng)養(yǎng)體呈復(fù)染液顏色（如紅色），二者對(duì)比鮮明，為細(xì)菌的形態(tài)觀察和分類鑒定提供可靠依據(jù)。
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