細(xì)菌L型分離瓊脂培養(yǎng)基的原理和使用方法及注意事項(xiàng)！
小楊 / 2025-09-19 09:18:09
細(xì)菌L型分離瓊脂培養(yǎng)基的核心原理是通過(guò)去除抑制成分、提供低滲等滲環(huán)境并添加營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，滿足細(xì)胞壁缺陷型（L 型）細(xì)菌的生長(zhǎng)需求，同時(shí)抑制雜菌繁殖；使用方法需嚴(yán)格遵循標(biāo)本處理、接種、培養(yǎng)及鑒定的標(biāo)準(zhǔn)化流程。
一、核心原理：為何能分離細(xì)菌 L 型？
細(xì)菌 L 型是細(xì)菌在某些因素（如抗生素、溶菌酶）作用下，細(xì)胞壁合成受阻形成的細(xì)胞壁缺陷型菌株，其結(jié)構(gòu)和生理特性與正常細(xì)菌差異極大，因此需要特殊培養(yǎng)基才能生長(zhǎng)。該培養(yǎng)基的設(shè)計(jì)圍繞以下 3 個(gè)關(guān)鍵需求：
1、低滲/等滲環(huán)境：保護(hù)無(wú)壁細(xì)菌
正常細(xì)菌的細(xì)胞壁能抵抗?jié)B透壓，而 L 型細(xì)菌無(wú)壁或壁不完整，在普通高滲培養(yǎng)基中易因吸水破裂。因此該培養(yǎng)基會(huì)：
降低瓊脂濃度（通常為 0.8%-1.0%，普通培養(yǎng)基為 1.5%-2.0%），形成更柔軟的凝膠環(huán)境，減少機(jī)械壓力。
部分配方會(huì)添加蔗糖、氯化鈉等物質(zhì)調(diào)節(jié)滲透壓，維持 L 型細(xì)菌的細(xì)胞形態(tài)穩(wěn)定，避免裂解。
2、營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化：滿足 L 型細(xì)菌代謝需求
L 型細(xì)菌因結(jié)構(gòu)缺陷，代謝能力較弱，需要更豐富的營(yíng)養(yǎng)：
基礎(chǔ)成分：蛋白胨、牛肉膏（提供氨基酸、維生素等）。
關(guān)鍵添加物：馬血清或小牛血清（提供生長(zhǎng)因子、脂質(zhì)等，是 L 型細(xì)菌生長(zhǎng)的必需成分）。
其他：部分配方會(huì)加入酵母浸膏，進(jìn)一步補(bǔ)充 B 族維生素，促進(jìn)生長(zhǎng)。
3、抑制雜菌：避免正常細(xì)菌干擾
標(biāo)本中可能含有大量正常細(xì)菌（細(xì)胞壁完整），其生長(zhǎng)速度遠(yuǎn)快于 L 型細(xì)菌，易覆蓋 L 型菌落。因此培養(yǎng)基會(huì)：
加入低濃度抗生素（如青霉素、頭孢類）：正常細(xì)菌對(duì)這些抗生素敏感（因有細(xì)胞壁，抗生素可作用于細(xì)胞壁合成），而 L 型細(xì)菌無(wú)細(xì)胞壁，對(duì)其不敏感，從而抑制正常細(xì)菌，保留 L 型細(xì)菌。
調(diào)節(jié) pH 值至 7.2-7.4（中性偏堿）：符合多數(shù) L 型細(xì)菌的生長(zhǎng) pH 范圍，同時(shí)抑制部分酸性環(huán)境偏好的雜菌。
二、使用方法：標(biāo)準(zhǔn)化操作流程
細(xì)菌 L 型分離培養(yǎng)需嚴(yán)格無(wú)菌操作，避免污染，具體步驟分為 5 步：
1、培養(yǎng)基準(zhǔn)備
復(fù)溶：取干粉培養(yǎng)基（按說(shuō)明書比例，如 100mL 水加 20-25g 干粉），加入蒸餾水或去離子水，加熱煮沸至完全溶解。
加血清：待培養(yǎng)基冷卻至 50-60℃（手摸瓶壁不燙手）時(shí)，加入 10%-20% 的無(wú)菌馬血清或小牛血清，輕輕搖勻（避免產(chǎn)生氣泡）。
滅菌與倒板：若未預(yù)加抗生素，需先 121℃高壓滅菌 15 分鐘（滅菌后冷卻至 50-60℃），再加入過(guò)濾除菌的抗生素（避免高溫破壞抗生素）；最后將培養(yǎng)基倒入無(wú)菌培養(yǎng)皿，每皿約 15-20mL，平放冷卻凝固（形成平板）。
2、標(biāo)本處理
常見標(biāo)本包括血液、膿液、尿液、腦脊液等，需根據(jù)標(biāo)本類型處理：
血液/腦脊液：取 1-2mL，直接接種（或低速離心 5 分鐘，取上清接種，避免紅細(xì)胞干擾）。
膿液/痰液：用無(wú)菌生理鹽水稀釋 10 倍（減少黏液和雜菌濃度），取 0.1-0.2mL 接種。
尿液：離心（3000rpm，10 分鐘），棄上清，取沉渣用生理鹽水重懸后接種。
3、接種操作
無(wú)菌操作：在生物安全柜或超凈工作臺(tái)內(nèi)進(jìn)行，用無(wú)菌接種環(huán)蘸取處理后的標(biāo)本，在培養(yǎng)基表面劃線接種（采用分區(qū)劃線法，逐步稀釋標(biāo)本，便于形成單菌落）。
避免過(guò)度劃線：力度要輕，避免劃破培養(yǎng)基表面（L 型細(xì)菌生長(zhǎng)依賴培養(yǎng)基表面的血清成分，劃破后易導(dǎo)致營(yíng)養(yǎng)流失）。
4、培養(yǎng)條件
L 型細(xì)菌生長(zhǎng)緩慢（比正常細(xì)菌慢 2-3 倍），且需特殊氣體環(huán)境：
溫度：35-37℃（多數(shù) L 型細(xì)菌的最適生長(zhǎng)溫度），放入恒溫培養(yǎng)箱。
氣體：5%-10% CO?環(huán)境（部分 L 型細(xì)菌為兼性厭氧菌，CO?可促進(jìn)其生長(zhǎng)，可使用 CO?培養(yǎng)箱，或在培養(yǎng)皿外罩一個(gè)密封容器，內(nèi)放一小碗碳酸氫鈉溶液產(chǎn)生 CO?）。
培養(yǎng)時(shí)間：7-14 天（普通細(xì)菌 1-2 天即可生長(zhǎng)，L 型細(xì)菌需延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間，避免漏檢），期間每天觀察菌落生長(zhǎng)情況。
5、菌落觀察與鑒定
菌落特征：L 型細(xì)菌的菌落與正常細(xì)菌差異明顯，典型特征為“油煎蛋樣菌落”（中心致密，呈顆粒狀，邊緣稀疏透明，形似油煎蛋）；部分可呈顆粒狀或絲狀菌落。
鑒定步驟：
挑取可疑菌落，涂片染色（革蘭氏染色：L 型細(xì)菌多呈革蘭氏陰性，形態(tài)為球形、桿狀或絲狀）。
轉(zhuǎn)種試驗(yàn)：將可疑菌落轉(zhuǎn)種至普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂（無(wú)血清、無(wú)抗生素），若不生長(zhǎng)（或生長(zhǎng)差），再轉(zhuǎn)種至 L 型分離培養(yǎng)基仍能生長(zhǎng)，可初步判斷為細(xì)菌 L 型。
生化反應(yīng)或分子鑒定：進(jìn)一步通過(guò)生化試驗(yàn)（如糖發(fā)酵試驗(yàn)）或 PCR 檢測(cè)細(xì)菌特異性基因，確認(rèn) L 型細(xì)菌的種類（如
金黃色葡萄球菌 L 型、
大腸桿菌 L 型等）。
三、注意事項(xiàng)：避免操作失誤導(dǎo)致漏檢
血清質(zhì)量：血清需新鮮、無(wú)菌，若血清變質(zhì)（如渾濁、有沉淀），會(huì)抑制 L 型細(xì)菌生長(zhǎng)，甚至導(dǎo)致污染。
抗生素濃度：需嚴(yán)格按說(shuō)明書添加，濃度過(guò)高可能抑制 L 型細(xì)菌（雖 L 型無(wú)壁，但高濃度抗生素可能影響細(xì)胞膜），濃度過(guò)低則無(wú)法抑制雜菌。
培養(yǎng)時(shí)間：不可提前終止培養(yǎng)（如僅培養(yǎng) 3-5 天），否則可能因 L 型細(xì)菌未長(zhǎng)出而漏檢。
污染控制：整個(gè)操作過(guò)程需無(wú)菌，接種后的平板需倒置培養(yǎng)（避免冷凝水滴落污染菌落）。
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