血細胞計數(shù)板操作的準備工作與核心步驟及結(jié)果計算！
小楊 / 2025-09-19 09:52:21
百歐博偉生物：血細胞計數(shù)板操作需嚴格遵循“準備 - 加樣 - 計數(shù) - 清洗”四步流程，核心是確保加樣量準確、計數(shù)規(guī)則統(tǒng)一，以避免結(jié)果偏差。
一、操作前準備：工具與樣品預(yù)處理
1、工具準備與清潔
準備血細胞計數(shù)板（如改良牛鮑計數(shù)板）、配套蓋玻片、移液管（10μL 或 20μL）、顯微鏡、無菌生理鹽水（或樣品稀釋液）、吸水紙、鏡頭紙。
用清水沖洗計數(shù)板和蓋玻片，再用無水乙醇擦拭晾干，確保計數(shù)室（中央方格區(qū)域）無污漬、劃痕，避免影響觀察。
2、樣品稀釋（關(guān)鍵步驟）
若酵母懸液濃度過高（如肉眼可見渾濁），需用無菌生理鹽水梯度稀釋，目標是讓稀釋后菌液中，每 0.1μL 計數(shù)室內(nèi)的細胞數(shù)在5~50 個（太少會導(dǎo)致誤差大，太多會重疊難以計數(shù)）。
舉例：若預(yù)估原始濃度為 10?個 /mL，可先稀釋 100 倍（取 1mL 菌液 + 99mL 稀釋液），再取稀釋液 1mL+9mL 稀釋液，最終稀釋 1000 倍（10?³）。
若需區(qū)分死活細胞，可在稀釋液中加入少量 0.1% 美藍染液（菌液：染液 = 10:1），室溫靜置 3~5 分鐘后再計數(shù)（活菌無色，死菌藍色）。
二、加樣與鏡檢：核心操作步驟
1、放置蓋玻片
將干凈的蓋玻片平放在計數(shù)板的“計數(shù)室區(qū)域”（兩個計數(shù)室，左右各一個），確保蓋玻片邊緣與計數(shù)板的凹槽對齊，此時蓋玻片與計數(shù)室表面會形成一個高度為0.1mm的密閉空間（計數(shù)室體積的關(guān)鍵來源）。
2、滴加樣品
用移液管吸取稀釋后的酵母懸液，在蓋玻片的一側(cè)邊緣緩慢滴加（每次滴加 10~15μL 即可），利用 “毛細作用” 讓菌液自動充滿計數(shù)室，避免產(chǎn)生氣泡。
注意：不要直接滴在計數(shù)室中央，也不要擠壓蓋玻片，若菌液溢出或有氣泡，需擦去重新加樣（氣泡會導(dǎo)致細胞分布不均，影響計數(shù)）。
3、靜置與調(diào)焦
加樣后將計數(shù)板放在顯微鏡載物臺上，室溫靜置3~5 分鐘，讓酵母細胞充分沉降到計數(shù)室底部（避免細胞懸浮導(dǎo)致觀察時模糊）。
先使用10× 物鏡（低倍鏡）找到計數(shù)室的方格輪廓，再切換到40× 物鏡（高倍鏡），調(diào)節(jié)細準焦螺旋，直到能清晰看到圓形 / 橢圓形的酵母細胞（細胞壁清晰，無重影）。
三、細胞計數(shù)：遵循統(tǒng)一規(guī)則
1、確定計數(shù)區(qū)域
改良牛鮑計數(shù)板的計數(shù)室為“中央大方格”，內(nèi)部包含 25 個中方格，每個中方格又包含 16 個小方格（即“25×16”規(guī)格）；部分計數(shù)板為“16×25”規(guī)格（16 個中方格，每個含 25 個小方格），兩種規(guī)格計數(shù)邏輯一致。
通常選擇4 個角的中方格 + 中央 1 個中方格，共 5 個中方格進行計數(shù)（覆蓋區(qū)域均勻，減少誤差）。
2、計數(shù)規(guī)則（避免重復(fù) / 遺漏）
核心規(guī)則：計上不計下，計左不計右。即當細胞壓在方格線上時，只統(tǒng)計“方格上邊線”和“左邊線”上的細胞，“下邊線”和“右邊線”上的細胞不計入，避免同一細胞被多次統(tǒng)計。
若細胞成團（如 2~3 個細胞連在一起），需判斷是否為單個細胞聚集：若能清晰區(qū)分細胞壁，按單個細胞計數(shù)；若完全融合無法區(qū)分，需舍棄該團（或在記錄中注明，避免結(jié)果偏高）。
3、數(shù)據(jù)記錄
分別記錄 5 個中方格內(nèi)的細胞總數(shù)（若區(qū)分死活，需分別記錄無色活菌數(shù)和藍色死菌數(shù)），計算平均值（如 5 個中方格共計數(shù) 150 個細胞，則平均每個中方格 30 個）。
四、結(jié)果計算與工具清洗
1、濃度計算（關(guān)鍵公式）
以“25×16”規(guī)格計數(shù)板為例，公式如下：
原始菌液濃度（個 /mL）= 5 個中方格總細胞數(shù) × 5（換算成 1 個大方格細胞數(shù)） × 10?（體積換算系數(shù)） × 稀釋倍數(shù)
公式解讀：5 個中方格是 1 個大方格（計數(shù)室）的 1/5，因此 ×5 得到 1 個大方格（體積 0.1μL）的細胞數(shù)；1mL=10?個 0.1μL，因此 ×10?；最后 × 稀釋倍數(shù)，抵消稀釋帶來的濃度降低。
示例：5 個中方格共 120 個細胞，稀釋倍數(shù) 1000 倍，則原始濃度 = 120×5×10?×1000=6×10?個 /mL。
2、工具清洗與保存
計數(shù)完成后，立即用清水沖洗計數(shù)板和蓋玻片，去除殘留菌液（若有頑固污漬，可用軟毛刷輕輕刷洗計數(shù)室，避免劃傷）。
沖洗后用無水乙醇擦拭晾干，將計數(shù)板放入專用盒中，蓋玻片單獨存放，避免受潮或污染。
北京百歐博偉生物技術(shù)有限公司擁有對菌種、細胞、培養(yǎng)基、配套試劑等產(chǎn)品需求者的極優(yōu)質(zhì)服務(wù)，對購買項目的前期資料提供,中期合同保證,后期貨物跟蹤到最終售后的確保項目準確到位，都有相關(guān)人士進行維護,確保您在
微生物菌種查詢網(wǎng)中獲得最優(yōu)質(zhì)服務(wù)！也正因為此，北京百歐博偉生物技術(shù)有限公司與國內(nèi)外多家研制單位、生物制藥、第三方檢測機構(gòu)和科研院所院校、化工企業(yè)有著良好、長期和穩(wěn)定的合作關(guān)系！
下載附件
上一篇：細菌L型分離瓊脂培養(yǎng)基的原理和使用方法及注意事項！
下一篇：微生物菌種冷凍干燥和低溫冷凍保藏技術(shù)的操作規(guī)程！