微生物菌種冷凍干燥和低溫冷凍保藏技術(shù)的操作規(guī)程！
小楊 / 2025-09-22 09:41:05
百歐博偉生物：微生物菌種冷凍干燥保藏是長(zhǎng)期保存的首選方法（可保存數(shù)年至數(shù)十年），低溫冷凍保藏（-20℃/-80℃）則更適合中短期保存或作為應(yīng)急備份，兩者核心都是通過(guò)低溫和脫水降低微生物代謝活性，減少細(xì)胞損傷。
一、微生物菌種冷凍干燥保藏技術(shù)規(guī)程（長(zhǎng)期保存）
冷凍干燥（凍干）通過(guò)“凍結(jié) - 真空升華脫水”實(shí)現(xiàn)，關(guān)鍵是選擇合適的保護(hù)劑、控制凍結(jié)速率和真空度，最大限度減少冰晶對(duì)細(xì)胞的破壞。
1、前期準(zhǔn)備
菌種選擇：需選擇對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的菌種，此時(shí)細(xì)胞活性高、抗逆性強(qiáng)。避免使用衰亡期菌種，否則存活率極低。
試劑與器具：
保護(hù)劑：根據(jù)菌種類(lèi)型選擇，常用配方如下表。
器具：凍干管（硬質(zhì)玻璃，帶密封塞）、移液管、培養(yǎng)皿、真空冷凍干燥機(jī)、超凈工作臺(tái)、高壓滅菌鍋。
器具滅菌：凍干管、移液管等需 121℃高壓滅菌 20 分鐘，烘干后備用；保護(hù)劑需過(guò)濾除菌（0.22μm 濾膜）或低壓滅菌（115℃，15 分鐘），避免高溫破壞成分。
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2、菌懸液制備（超凈工作臺(tái)內(nèi)操作）
取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的菌種，用無(wú)菌生理鹽水或無(wú)菌培養(yǎng)基輕輕沖洗培養(yǎng)物，收集到無(wú)菌離心管中。
3000-5000rpm 離心 10-15 分鐘，棄上清液，保留菌體沉淀。
向沉淀中加入適量保護(hù)劑，輕輕吹打混勻，制成10^8 - 10^9 CFU/mL的菌懸液（濃度過(guò)低會(huì)導(dǎo)致復(fù)蘇困難）。
3、分裝與預(yù)凍結(jié)
用無(wú)菌移液管將菌懸液分裝到凍干管中，每管裝 1-2mL（液面高度不超過(guò)管高的 1/3，便于升華）。
將凍干管放入-80℃冰箱或液氮罐（氣相區(qū)，-150℃以下）預(yù)凍結(jié) 2-4 小時(shí)，確保菌懸液完全凍結(jié)（避免后續(xù)真空升華時(shí)出現(xiàn)沸騰，導(dǎo)致菌體流失）。
4、冷凍干燥（核心步驟）
將預(yù)凍結(jié)的凍干管連接到真空冷凍干燥機(jī)的樣品架上，確保密封良好。
啟動(dòng)凍干機(jī)，先抽真空至10-30Pa，然后開(kāi)啟加熱板（溫度控制在 0-5℃，緩慢升溫，避免冰晶快速融化）。
凍干過(guò)程持續(xù) 8-24 小時(shí)（根據(jù)菌懸液體積調(diào)整），直至凍干管內(nèi)物質(zhì)呈疏松的白色粉末狀，無(wú)明顯水分（可用重量法判斷：凍干后重量穩(wěn)定，不再下降）。
5、密封與保存
凍干結(jié)束后，在真空狀態(tài)下用火焰熔封凍干管（或用無(wú)菌橡膠塞密封，外層套鋁蓋），確保無(wú)漏氣。
標(biāo)記凍干管：注明菌種名稱、菌株編號(hào)、凍干日期、操作人員。
保存條件：4℃冰箱（短期，1-2 年）或-20℃冰箱（長(zhǎng)期，5-10 年），避免反復(fù)凍融。
6、復(fù)蘇與質(zhì)量檢測(cè)
復(fù)蘇：用無(wú)菌鑷子敲碎凍干管，加入 1-2mL 無(wú)菌培養(yǎng)基，輕輕吹打溶解凍干物，取 0.1-0.2mL 涂布平板或接種液體培養(yǎng)基，37℃（或菌種最適溫度）培養(yǎng) 18-24 小時(shí)。
質(zhì)量檢測(cè)：
存活率：計(jì)數(shù)平板上的菌落數(shù)，計(jì)算復(fù)蘇后的存活率（需≥50%，否則視為保藏失?。?。
純度：觀察菌落形態(tài)，鏡檢確認(rèn)無(wú)雜菌污染；必要時(shí)進(jìn)行生化試驗(yàn)或分子鑒定，確保菌種未發(fā)生變異。
二、微生物菌種低溫冷凍保藏技術(shù)規(guī)程（中短期保存）
低溫冷凍保藏通過(guò)低溫（-20℃/-80℃）直接抑制微生物代謝，操作簡(jiǎn)單、成本低，但保存時(shí)間較短（-20℃約 6-12 個(gè)月，-80℃約 1-3 年），需添加保護(hù)劑防止細(xì)胞結(jié)冰損傷。
1、適用范圍
適合細(xì)菌、酵母菌、真菌菌絲體或孢子，不適合對(duì)低溫敏感的極端微生物（如嗜熱菌）。
2、前期準(zhǔn)備
保護(hù)劑：首選15%-20% 甘油（細(xì)菌、酵母菌）或10%-15% 二甲基亞砜（DMSO）（真菌、動(dòng)物細(xì)胞），需無(wú)菌處理（0.22μm 濾膜過(guò)濾）。
器具：無(wú)菌冷凍管（聚丙烯材質(zhì)，耐低溫）、移液管、超凈工作臺(tái)、-20℃/-80℃冰箱。
3、操作步驟（超凈工作臺(tái)內(nèi)）
菌懸液制備：同冷凍干燥步驟，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期菌種，用無(wú)菌生理鹽水離心收集菌體，加入無(wú)菌保護(hù)劑，制成 10^8 - 10^9 CFU/mL 的菌懸液。
分裝：將菌懸液分裝到無(wú)菌冷凍管中，每管 1-1.5mL，蓋緊蓋子并標(biāo)記（菌種名稱、編號(hào)、保藏日期）。
梯度降溫（關(guān)鍵！減少冰晶損傷）：
先將冷凍管放入4℃冰箱1 小時(shí)，讓菌體適應(yīng)低溫。
轉(zhuǎn)移至-20℃冰箱2-4 小時(shí)，使菌懸液緩慢凍結(jié)。
最終放入-80℃冰箱長(zhǎng)期保存（若用 - 20℃冰箱，保存時(shí)間不超過(guò) 6 個(gè)月）。
（可選）若有程序降溫儀，可設(shè)置“1℃/ 分鐘”的降溫速率，從 4℃降至 - 80℃，存活率更高。
4、復(fù)蘇與注意事項(xiàng)
復(fù)蘇：從 - 80℃冰箱取出冷凍管，立即放入37℃水浴鍋中快速融化（1-2 分鐘內(nèi)完全融化，避免冰晶反復(fù)形成損傷細(xì)胞），然后按凍干復(fù)蘇方法接種培養(yǎng)。
注意事項(xiàng)：
冷凍管取出后需一次性復(fù)蘇完畢，禁止反復(fù)凍融（可分裝多管，每次取 1 管使用）。
每 3-6 個(gè)月需抽樣復(fù)蘇檢測(cè)，確認(rèn)菌種活性和純度，若存活率低于 30%，需重新制備保藏。
三、兩種保藏技術(shù)對(duì)比
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