革蘭陰性桿菌分科顯色培養(yǎng)基的使用方法及操作流程！
小楊 / 2025-09-26 09:17:38
革蘭陰性桿菌分科顯色培養(yǎng)基的使用需遵循“準(zhǔn)備 - 接種 - 培養(yǎng) - 觀察”的核心流程，關(guān)鍵是嚴(yán)格控制無菌操作和培養(yǎng)條件，以確保菌落顯色準(zhǔn)確、鑒定可靠。
一、使用前準(zhǔn)備：確保培養(yǎng)基狀態(tài)合格
使用前需完成培養(yǎng)基的復(fù)蘇（若為干粉或冷凍狀態(tài)）和質(zhì)量檢查，避免因培養(yǎng)基失效導(dǎo)致結(jié)果誤差。
1、培養(yǎng)基處理
若為預(yù)制平板（市售即用型）：直接從 4℃冰箱取出，室溫放置 20-30 分鐘，待平板溫度恢復(fù)至室溫（避免接種后冷凝水影響菌落形態(tài)），同時(shí)檢查平板是否有破損、污染（如出現(xiàn)不明菌落、霉斑）或干燥（培養(yǎng)基表面開裂），不合格者直接丟棄。
若為干粉培養(yǎng)基：需按說明書比例（如 1000ml 蒸餾水加 35g 干粉）溶解，加熱煮沸至完全透明（避免反復(fù)煮沸），分裝到培養(yǎng)皿中（每皿約 15-20ml），121℃高壓蒸汽滅菌 15-20 分鐘，滅菌后自然冷卻至室溫（倒置避免灰塵污染），凝固后 4℃密封保存，保存時(shí)間不超過說明書規(guī)定（通常 1-2 周）。
2、工具與環(huán)境準(zhǔn)備
無菌工具：接種環(huán)（或接種針、無菌棉簽）、移液器（配無菌吸頭）、酒精燈、標(biāo)簽紙、記號(hào)筆。
環(huán)境：超凈工作臺(tái)（提前 30 分鐘開啟紫外消毒，消毒后通風(fēng) 10 分鐘）或無菌實(shí)驗(yàn)室，避免雜菌污染。
二、樣本接種：無菌操作是核心
接種需根據(jù)樣本類型（如臨床標(biāo)本、環(huán)境樣本）選擇合適方法，確保樣本均勻涂布，以便形成清晰可辨的單菌落。
1、樣本預(yù)處理（按需）
若樣本含菌量過高：需用無菌生理鹽水進(jìn)行梯度稀釋（通常 10?¹ 至 10??倍），避免菌落過于密集、重疊，無法觀察單個(gè)菌落顯色。
若為液體樣本：可直接取 0.1-0.2ml 樣本，或離心（3000rpm，5 分鐘）后取沉淀接種；若為固體樣本（如組織、土壤）：取少量樣本（約 0.5g）加入無菌生理鹽水，振蕩混勻后取上清接種。
2、接種方法（常用 2 種）
涂布法（推薦，適用于大多數(shù)樣本）：用無菌移液器取處理后的樣本（0.1ml）滴在培養(yǎng)基表面，用無菌 L 型玻棒將樣本均勻涂抹在整個(gè)培養(yǎng)基表面，涂抹后可將平板倒置放置 5-10 分鐘，讓樣本吸收，避免開蓋時(shí)間過長(zhǎng)。
劃線法（適用于含菌量較低的樣本）：將接種環(huán)在酒精燈上灼燒滅菌（待冷卻，避免燙死細(xì)菌），蘸取少量樣本，在培養(yǎng)基表面按“分區(qū)劃線法”劃線（第一區(qū)劃線后灼燒接種環(huán)，冷卻后從第一區(qū)末端劃第二區(qū)，以此類推），最終在劃線末端形成單菌落。
3、標(biāo)記信息
在培養(yǎng)皿蓋邊緣用記號(hào)筆標(biāo)注樣本名稱、接種日期、操作者姓名及培養(yǎng)基類型，避免混淆。
三、培養(yǎng)條件：控制溫度與氧氣，確保顯色反應(yīng)
不同革蘭陰性桿菌的生長(zhǎng)需求不同，需嚴(yán)格按培養(yǎng)基說明書設(shè)定培養(yǎng)條件，這是菌落顯色的關(guān)鍵。
1、培養(yǎng)溫度
絕大多數(shù)腸道革蘭陰性桿菌（如
大腸埃希菌、
沙門氏菌）：需在35-37℃ 恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，這是其最適生長(zhǎng)溫度，能保證顯色底物與細(xì)菌酶的反應(yīng)效率。
特殊菌種（如某些環(huán)境來源的
革蘭陰性桿菌）：需按說明書調(diào)整溫度（如 28℃或 42℃），避免溫度不當(dāng)導(dǎo)致細(xì)菌不生長(zhǎng)或顯色異常。
2、培養(yǎng)時(shí)間與氧氣
培養(yǎng)時(shí)間：通常為18-24 小時(shí)，部分慢生長(zhǎng)菌種（如某些
克雷伯菌、
不動(dòng)桿菌）需延長(zhǎng)至 48 小時(shí)，但需注意：培養(yǎng)時(shí)間過長(zhǎng)可能導(dǎo)致菌落過大、顏色滲透，影響判斷；時(shí)間過短則細(xì)菌未充分生長(zhǎng)，顯色不明顯。
氧氣條件：多數(shù)革蘭陰性桿菌為需氧菌，直接有氧培養(yǎng)即可；若需分離兼性厭氧菌（如
大腸埃希菌），無需特殊厭氧環(huán)境，常規(guī)培養(yǎng)箱即可滿足。
四、結(jié)果觀察與判斷：依據(jù)顯色特征分科 / 鑒定
培養(yǎng)結(jié)束后，根據(jù)培養(yǎng)基說明書中“目標(biāo)菌顯色標(biāo)準(zhǔn)”，觀察菌落顏色、形態(tài)（如大小、邊緣、是否有粘液 / 光暈），初步判斷菌種類型。
1、觀察要點(diǎn)
先觀察整體：是否有雜菌污染（如出現(xiàn)與目標(biāo)顯色不符的異常菌落，需排除操作污染）；
再聚焦單菌落：記錄單個(gè)菌落的顏色（如麥康凱瓊脂上，乳糖陽性菌為紅色，陰性菌為無色）、形態(tài)（如克雷伯菌顯色培養(yǎng)基上，目標(biāo)菌為紫色粘液狀菌落）、是否有特殊特征（如 SS 瓊脂上，沙門氏菌若產(chǎn)硫化氫，菌落中心呈黑色）。
常見培養(yǎng)基判斷示例（結(jié)合前文）
培養(yǎng)基類型 目標(biāo)菌顯色特征 非目標(biāo)菌特征
麥康凱瓊脂 乳糖陽性菌（如大腸埃希菌）：紅色菌落 乳糖陰性菌（如沙門氏菌）：無色菌落
不動(dòng)桿菌顯色培養(yǎng)基 鮑曼不動(dòng)桿菌：淡紫色菌落，有光暈 其他革蘭陰性菌：無色或非淡紫色菌落
SS 瓊脂 沙門氏菌（產(chǎn)硫化氫）：無色菌落，中心黑 大腸埃希菌：紅色或粉紅色菌落
2、注意事項(xiàng)
若顯色不清晰（如顏色淺、無明顯差異）：需排查原因（如培養(yǎng)基過期、培養(yǎng)時(shí)間不足、樣本處理不當(dāng)），必要時(shí)重新接種；
顯色結(jié)果僅為初步鑒定：最終確診需結(jié)合生化反應(yīng)、分子生物學(xué)檢測(cè)等進(jìn)一步驗(yàn)證，避免僅憑顯色誤判。
五、后續(xù)處理：避免污染與記錄歸檔
1、廢棄處理
培養(yǎng)后的培養(yǎng)基（無論是否有目標(biāo)菌）均為“生物危害廢物”，需放入專用醫(yī)療廢物袋，經(jīng)高壓蒸汽滅菌（121℃，30 分鐘）后再丟棄，避免環(huán)境或人員感染。
用過的接種環(huán)、吸頭等工具：需灼燒滅菌或浸泡在含氯消毒劑中 30 分鐘以上，再按醫(yī)療廢物處理。
2、記錄歸檔
詳細(xì)記錄樣本信息、培養(yǎng)基類型、接種方法、培養(yǎng)條件、菌落顯色特征及初步判斷結(jié)果，形成實(shí)驗(yàn)記錄，便于后續(xù)追溯或復(fù)查。
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