細(xì)胞培養(yǎng)基的準(zhǔn)備工作、配制與使用方法及后續(xù)處理！
小楊 / 2025-09-26 09:55:35
細(xì)胞培養(yǎng)基的使用核心是嚴(yán)格遵循無菌操作和匹配細(xì)胞需求，從解凍、配制到使用后處理，每一步都直接影響細(xì)胞的生長狀態(tài)和實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
正確使用
細(xì)胞培養(yǎng)基需遵循“準(zhǔn)備 - 配制 - 使用 - 后續(xù)處理”的流程，同時(shí)要特別注意無菌環(huán)境、成分匹配和儲(chǔ)存條件這三個(gè)關(guān)鍵要素。
一、使用前準(zhǔn)備：核心是“無菌”與“匹配”
在開始操作前，必須完成兩項(xiàng)基礎(chǔ)工作，避免后續(xù)污染或細(xì)胞不適應(yīng)。
1、確認(rèn)培養(yǎng)基類型與細(xì)胞匹配
不同細(xì)胞（如貼壁細(xì)胞、懸浮細(xì)胞、干細(xì)胞）對(duì)營養(yǎng)的需求差異極大，必須選擇對(duì)應(yīng)的培養(yǎng)基。
特殊細(xì)胞（如
胚胎干細(xì)胞）：需使用專用的干細(xì)胞培養(yǎng)基，并添加特定細(xì)胞因子。
關(guān)鍵檢查：核對(duì)培養(yǎng)基名稱、批號(hào)、有效期，確認(rèn)是否需要額外添加成分（如血清、抗生素、谷氨酰胺）。
2、準(zhǔn)備無菌操作環(huán)境與工具
環(huán)境：在生物安全柜內(nèi)進(jìn)行所有操作，提前 30 分鐘打開紫外燈消毒，操作前用 75% 酒精擦拭臺(tái)面。
工具：移液器、離心管、培養(yǎng)皿等需滅菌，瓶口開啟后用酒精燈火焰快速過一下（避免長時(shí)間灼燒）。
試劑：將培養(yǎng)基、血清等從冰箱取出，在室溫下放置 20-30 分鐘（或在 37℃水浴鍋快速解凍，避免反復(fù)凍融），待溫度回升至室溫后再使用。
二、培養(yǎng)基配制：分“基礎(chǔ)型”和“添加型”
大部分商用培養(yǎng)基為“基礎(chǔ)培養(yǎng)基”，需根據(jù)細(xì)胞需求添加補(bǔ)充成分，常見兩種配制場景：
1、基礎(chǔ)培養(yǎng)基（無需添加成分）
直接從儲(chǔ)存條件（通常 2-8℃冷藏）取出，待溫度恢復(fù)至室溫后，輕輕顛倒混勻 3-5 次（避免劇烈搖晃產(chǎn)生過多氣泡，氣泡會(huì)影響細(xì)胞貼壁）。
若發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基出現(xiàn)渾濁、沉淀、顏色異常（如 pH 值異常導(dǎo)致的變黃或變紫），則不可使用。
2、需添加補(bǔ)充成分的培養(yǎng)基（最常用）
以“基礎(chǔ)培養(yǎng)基 + 胎牛血清（FBS）+ 抗生素”的經(jīng)典組合為例，步驟如下：
取無菌離心管，按比例加入基礎(chǔ)培養(yǎng)基（如 89mL）。
加入血清（通常終濃度 10%，即 10mL 胎牛血清），輕輕吹打混勻（避免血清掛壁浪費(fèi)）。
加入抗生素（如青霉素 - 鏈霉素混合液，終濃度 1%，即 1mL），再次混勻。
配制完成后，可取樣檢測 pH 值（正常細(xì)胞培養(yǎng)基 pH 通常為 7.2-7.4，顏色呈淡紅色或桃紅色），若 pH 偏酸（變黃），可滴加少量無菌的 NaHCO?溶液調(diào)節(jié)；若偏堿（變紫），可通入少量無菌 CO?。
配制好的完全培養(yǎng)基需在 2-8℃冷藏保存，且保存時(shí)間不超過 2 周（避免成分降解），使用前需再次混勻。
三、培養(yǎng)基使用：分“細(xì)胞接種”和“換液”場景
1、細(xì)胞接種（新細(xì)胞培養(yǎng)或傳代時(shí)）
準(zhǔn)備好待接種的細(xì)胞懸液（傳代時(shí)需先消化、離心收集細(xì)胞），調(diào)整細(xì)胞濃度至合適范圍（如 1×10? - 1×10? cells/mL，具體濃度根據(jù)細(xì)胞類型調(diào)整）。
向培養(yǎng)皿 / 培養(yǎng)瓶中加入配制好的完全培養(yǎng)基（如 6 孔板每孔加 2-3mL，T25 培養(yǎng)瓶加 5-8mL）。
按比例加入細(xì)胞懸液（如 6 孔板每孔加入 1mL 細(xì)胞懸液），輕輕搖晃培養(yǎng)皿 / 瓶，使細(xì)胞均勻分布（避免細(xì)胞聚集在中心）。
將培養(yǎng)皿 / 瓶放入 37℃、5% CO?的細(xì)胞培養(yǎng)箱中，靜置培養(yǎng)（貼壁細(xì)胞需培養(yǎng) 24 小時(shí)左右才能完全貼壁，期間盡量不移動(dòng)培養(yǎng)箱）。
2、細(xì)胞換液（細(xì)胞培養(yǎng)過程中）
目的：去除細(xì)胞代謝產(chǎn)生的廢物（如乳酸），補(bǔ)充新鮮營養(yǎng)，維持細(xì)胞生長環(huán)境穩(wěn)定。
頻率：通常貼壁細(xì)胞每 2-3 天換液一次，懸浮細(xì)胞每 1-2 天換液一次（具體根據(jù)細(xì)胞密度和培養(yǎng)基顏色判斷，若培養(yǎng)基變黃則需及時(shí)換液）。
步驟：
從培養(yǎng)箱中取出培養(yǎng)皿 / 瓶，在生物安全柜內(nèi)操作。
貼壁細(xì)胞：輕輕傾斜培養(yǎng)皿，用移液器吸走舊培養(yǎng)基（注意吸頭不要觸碰細(xì)胞層，避免損傷細(xì)胞）。
懸浮細(xì)胞：先將培養(yǎng)瓶中的細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至無菌離心管，1000-1500rpm 離心 5 分鐘，棄去上清舊培養(yǎng)基，加入新鮮培養(yǎng)基重懸細(xì)胞后，再轉(zhuǎn)移回培養(yǎng)瓶。
向培養(yǎng)皿 / 瓶中加入新鮮的完全培養(yǎng)基，放回培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。
四、使用后處理：避免污染與浪費(fèi)
1、剩余培養(yǎng)基處理
未開封的培養(yǎng)基：按說明書要求儲(chǔ)存（2-8℃冷藏或 - 20℃冷凍），避免陽光直射。
已開封的基礎(chǔ)培養(yǎng)基：2-8℃冷藏，1 個(gè)月內(nèi)使用完畢，每次使用后及時(shí)擰緊瓶蓋。
已配制的完全培養(yǎng)基：2-8℃冷藏，2 周內(nèi)使用完畢，不可反復(fù)凍融。
2、污染處理
若發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基渾濁、出現(xiàn)白色 / 綠色絮狀物（細(xì)菌或真菌污染），需立即停止使用，將污染的培養(yǎng)物、培養(yǎng)基等放入專用醫(yī)療廢棄物袋，按生物安全規(guī)范處理（不可直接倒入下水道）。
污染后的操作工具需用 121℃高壓蒸汽滅菌 30 分鐘，生物安全柜需重新消毒（用含氯消毒劑擦拭后再開紫外燈）。
3、器具清洗
用過的培養(yǎng)皿、離心管等一次性器具，需放入醫(yī)療廢棄物專用容器；可重復(fù)使用的玻璃器具，需先浸泡在含氯消毒劑中 30 分鐘，再用清水沖洗干凈，烘干后滅菌備用。
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