腦膜炎球菌培養(yǎng)的準(zhǔn)備工作與具體操作流程及關(guān)鍵注意事項(xiàng)！
小楊 / 2025-10-11 09:04:34
培養(yǎng)
腦膜炎球菌（Neisseria meningitidis）的核心是緊扣其“苛養(yǎng)性”（需特殊營(yíng)養(yǎng)、微需氧環(huán)境）和“易失活性”（標(biāo)本離體后易死亡），操作流程需嚴(yán)格遵循“標(biāo)本預(yù)處理→培養(yǎng)基準(zhǔn)備與接種→培養(yǎng)環(huán)境控制→菌落觀察與初步鑒定→后續(xù)驗(yàn)證”的邏輯，每一步均需精準(zhǔn)控制條件，具體如下：
一、操作前準(zhǔn)備：材料與環(huán)境要求
在開始培養(yǎng)前，需確保所有材料無(wú)菌、環(huán)境合規(guī)，避免雜菌污染或細(xì)菌失活。
1、核心材料準(zhǔn)備
類別 具體物品及要求
標(biāo)本相關(guān) 臨床標(biāo)本：腦脊液（首選，發(fā)病 24 小時(shí)內(nèi)采集）、血液、咽拭子；標(biāo)本容器：無(wú)菌帶蓋離心管、無(wú)菌抗凝管（血液用），均需預(yù)溫至 35~37℃（避免低溫?fù)p傷細(xì)菌）。
培養(yǎng)基 基礎(chǔ)培養(yǎng)基：巧克力瓊脂平板（核心！需新鮮制備，24 小時(shí)內(nèi)使用；原理：加熱羊血使血紅蛋白釋放，提供維生素 B 族、鐵離子等營(yíng)養(yǎng)，滿足腦膜炎球菌苛養(yǎng)需求）；選擇培養(yǎng)基：改良 Thayer-Martin（TM）培養(yǎng)基（含萬(wàn)古霉素、制霉菌素，抑制革蘭氏陽(yáng)性菌、革蘭氏陰性雜菌及真菌，僅允許腦膜炎球菌、淋病奈瑟菌生長(zhǎng)，適合污染標(biāo)本如咽拭子）；增菌肉湯：腦心浸液（BHI）肉湯（含葡萄糖、胰蛋白胨，用于血液標(biāo)本或少量腦脊液的預(yù)增菌，避免細(xì)菌數(shù)量過(guò)少導(dǎo)致漏檢）。
儀器與耗材 培養(yǎng)設(shè)備：5% CO?培養(yǎng)箱（需提前校準(zhǔn) CO?濃度、溫度，濕度控制在 80%~90%，避免培養(yǎng)基干燥）；無(wú)菌耗材：離心儀（3000rpm 可調(diào)）、無(wú)菌接種環(huán)、無(wú)菌吸管（1mL/5mL）、氧化酶試劑、革蘭氏染色液；防護(hù)用品：生物安全柜（二級(jí)及以上，因腦膜炎球菌可通過(guò)飛沫傳播，需防實(shí)驗(yàn)室感染）、無(wú)菌手套、口罩、護(hù)目鏡。
質(zhì)量控制（QC）品 陽(yáng)性對(duì)照菌：腦膜炎球菌標(biāo)準(zhǔn)株（如
ATCC 13090，驗(yàn)證培養(yǎng)基和培養(yǎng)環(huán)境有效性）；陰性對(duì)照菌：
大腸桿菌（
ATCC 25922，驗(yàn)證選擇培養(yǎng)基的抑制效果）。
2、環(huán)境準(zhǔn)備
所有操作需在生物安全柜內(nèi)進(jìn)行，提前 30 分鐘開啟紫外消毒（消毒后通風(fēng) 15 分鐘）；
培養(yǎng)箱提前 1 小時(shí)預(yù)熱至 35~37℃，通入 5% CO?（不可過(guò)高，CO?>10% 會(huì)抑制細(xì)菌生長(zhǎng)），并檢查濕度（可在培養(yǎng)箱內(nèi)放置盛水托盤維持濕度）。
二、標(biāo)本預(yù)處理：分類型處理，減少細(xì)菌失活
腦膜炎球菌對(duì)環(huán)境敏感（低溫、干燥易死亡），標(biāo)本采集后需1 小時(shí)內(nèi)送檢并處理，不同標(biāo)本處理方式差異顯著：
1、腦脊液標(biāo)本（最常用于腦膜炎診斷）
步驟 1：接收標(biāo)本后，立即觀察外觀（化膿性腦膜炎患者腦脊液多渾濁，需優(yōu)先處理）；
步驟 2：離心富集細(xì)菌 —— 將腦脊液移入無(wú)菌離心管，3000rpm 離心 10 分鐘（轉(zhuǎn)速不可過(guò)高，避免破壞細(xì)菌）；
步驟 3：棄上清液，保留底部 0.2~0.5mL 沉淀（含高濃度細(xì)菌），用無(wú)菌吸管輕輕吹打沉淀，使細(xì)菌均勻懸?。ū苊庥昧^(guò)猛導(dǎo)致細(xì)菌破裂）。
2、血液標(biāo)本（用于敗血癥型腦膜炎球菌感染）
步驟 1：若標(biāo)本量少（<2mL）：直接取 0.5mL 抗凝血，滴加于巧克力瓊脂平板和改良 TM 平板，用無(wú)菌 L 型玻棒均勻涂布（避免血液過(guò)多覆蓋菌落）；
步驟 2：若標(biāo)本量多（>2mL）：先增菌 —— 取 1mL 抗凝血加入 9mL 無(wú)菌 BHI 肉湯（含 1% 葡萄糖），35~37℃ 5% CO?培養(yǎng) 6~8 小時(shí)（待肉湯輕度渾濁），再取 0.1mL 增菌液接種至上述兩種平板（提高檢出率）。
3、咽拭子標(biāo)本（流行病學(xué)篩查）
步驟 1：立即洗脫 —— 將咽拭子放入 3mL 無(wú)菌 BHI 肉湯中，反復(fù)擠壓拭子頭部（使細(xì)菌充分洗脫），棄去拭子；
步驟 2：選擇培養(yǎng) —— 取 0.5mL 洗脫液接種至改良 TM 平板（因咽拭子含大量雜菌，需選擇培養(yǎng)基抑制干擾），用接種環(huán)劃線（分區(qū)劃線法，保證單菌落生長(zhǎng)）。
三、培養(yǎng)基接種：精準(zhǔn)劃線，保證單菌落
接種是分離單菌落的關(guān)鍵，需根據(jù)標(biāo)本類型選擇培養(yǎng)基，并采用規(guī)范劃線方法：
1、培養(yǎng)基選擇原則
標(biāo)本類型 首選培養(yǎng)基 次選 / 輔助培養(yǎng)基 目的
腦脊液 巧克力瓊脂平板 改良 TM 平板 巧克力培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)豐富，適合純培養(yǎng)；改良 TM 用于排除雜菌（若腦脊液污染）
血液 巧克力瓊脂平板 BHI 肉湯（增菌用） 直接接種平板觀察菌落，增菌用于低細(xì)菌載量標(biāo)本
咽拭子 改良 TM 平板 巧克力瓊脂平板 優(yōu)先抑制雜菌，巧克力平板用于觀察菌落形態(tài)
2、接種操作步驟
步驟 1：點(diǎn)燃酒精燈，將無(wú)菌接種環(huán)在火焰上滅菌（從環(huán)端到柄端，避免驟冷），待環(huán)冷卻（觸碰培養(yǎng)基邊緣無(wú)蒸汽，避免燙死細(xì)菌）；
步驟 2：取預(yù)處理后的標(biāo)本（如腦脊液沉淀、血液涂布液），在平板邊緣第 1 區(qū)輕輕劃線（線條密集，接種細(xì)菌量多）；
步驟 3：滅菌接種環(huán)并冷卻，從第 1 區(qū)劃線末端延伸至第 2 區(qū)劃線（線條稀疏，減少細(xì)菌量）；重復(fù)此操作至第 4 區(qū)或第 5 區(qū)（每區(qū)劃線不重疊，最終在第 4/5 區(qū)形成單菌落）；
步驟 4：接種完成后，在平板蓋內(nèi)側(cè)標(biāo)注標(biāo)本編號(hào)、接種日期、培養(yǎng)基類型，倒置平板（避免冷凝水滴落污染菌落）。
四、培養(yǎng)環(huán)境控制：嚴(yán)格維持微需氧與溫濕度
腦膜炎球菌的生長(zhǎng)依賴5% CO?+35~37℃+ 高濕度，需實(shí)時(shí)監(jiān)控培養(yǎng)箱參數(shù)：
1、培養(yǎng)箱設(shè)置
溫度：穩(wěn)定控制在 35~37℃（低于 30℃或高于 40℃會(huì)抑制細(xì)菌生長(zhǎng)，甚至導(dǎo)致死亡）；
CO?濃度：5%（通過(guò)培養(yǎng)箱自帶的 CO?傳感器監(jiān)測(cè)，若濃度不足，可在培養(yǎng)箱內(nèi)放置碳酸氫鈉溶液輔助調(diào)節(jié)，但需定期更換）；
濕度：80%~90%（通過(guò)放置盛無(wú)菌水的托盤實(shí)現(xiàn)，每日檢查水位，避免干涸）。
2、培養(yǎng)時(shí)間與觀察頻率
首次觀察：培養(yǎng) 18~24 小時(shí)后取出平板，觀察菌落形態(tài)（多數(shù)腦膜炎球菌在此時(shí)間段生長(zhǎng)成熟）；
二次觀察：若 18~24 小時(shí)無(wú)菌落生長(zhǎng)，需繼續(xù)培養(yǎng)至 48 小時(shí)（部分弱毒菌株或低載量標(biāo)本生長(zhǎng)緩慢）；
注意：48 小時(shí)后仍無(wú)菌落，可判定為“培養(yǎng)陰性”（需排除標(biāo)本處理不當(dāng)或培養(yǎng)基失效）。
五、菌落觀察與初步鑒定：排除干擾，確認(rèn)疑似菌落
腦膜炎球菌的菌落有典型形態(tài)，需結(jié)合染色和生化試驗(yàn)初步鑒定：
1、典型菌落特征（巧克力瓊脂平板上）
形態(tài)：圓形、光滑、濕潤(rùn)、邊緣整齊，直徑 1~2mm，呈“露滴狀”或“水珠狀”（透明或半透明，光線照射下有光澤）；
質(zhì)地：用接種環(huán)觸碰菌落，質(zhì)地柔軟，易被挑起（無(wú)黏性，與肺炎鏈球菌的“黏液狀”菌落區(qū)分）；
溶血：無(wú)溶血環(huán)（巧克力培養(yǎng)基為加熱去纖維羊血，無(wú)完整紅細(xì)胞，故無(wú)溶血現(xiàn)象，可與溶血細(xì)菌區(qū)分）。
2、初步鑒定試驗(yàn)（挑取單菌落進(jìn)行）
試驗(yàn) 1：革蘭氏染色（關(guān)鍵鑒別）
操作：取單菌落涂片，干燥后革蘭氏染色（結(jié)晶紫初染→碘液媒染→95% 乙醇脫色→復(fù)紅復(fù)染）；
結(jié)果：鏡下為革蘭氏陰性雙球菌，呈“腎形”或“咖啡豆形”排列（成對(duì)存在，凹面相對(duì)，與淋病奈瑟菌形態(tài)相似，但需進(jìn)一步區(qū)分）。
試驗(yàn) 2：氧化酶試驗(yàn)（快速篩查）
操作：滴 1 滴新鮮氧化酶試劑于菌落表面（避免滴在培養(yǎng)基上，防止假陽(yáng)性）；
結(jié)果：10~30 秒內(nèi)菌落呈紫色或深藍(lán)色（氧化酶陽(yáng)性，奈瑟菌屬特征，排除氧化酶陰性的雜菌如大腸桿菌）。
六、后續(xù)驗(yàn)證：明確菌種，排除混淆
初步鑒定為“疑似腦膜炎球菌”后，需通過(guò)生化試驗(yàn)和血清學(xué)試驗(yàn)確認(rèn)，避免與同屬的淋病奈瑟菌混淆：
1、生化發(fā)酵試驗(yàn)（核心鑒別）
原理：
腦膜炎球菌僅分解葡萄糖和麥芽糖，不分解乳糖、蔗糖；淋病奈瑟菌僅分解葡萄糖，不分解麥芽糖（關(guān)鍵差異）；
操作：將疑似菌落接種至含葡萄糖、麥芽糖、乳糖、蔗糖的糖發(fā)酵管（含酚紅指示劑），35~37℃ 5% CO?培養(yǎng) 24 小時(shí)；
結(jié)果：葡萄糖發(fā)酵管和麥芽糖發(fā)酵管變酸（黃色），乳糖、蔗糖管不變色（紅色） → 確診為腦膜炎球菌。
2、血清學(xué)試驗(yàn)（分型鑒定，可選）
目的：確定腦膜炎球菌的血清群（如 A、B、C、Y、W135 群，用于流行病學(xué)分析和臨床治療參考）；
操作：取單菌落涂片，滴加對(duì)應(yīng)血清群的特異性抗血清，觀察是否出現(xiàn)凝集反應(yīng)（凝集為陽(yáng)性，確定血清群）。
七、操作后處理：生物安全與質(zhì)量控制
1、生物安全處理
培養(yǎng)后的平板（無(wú)論陽(yáng)性 / 陰性）需高壓滅菌（121℃，20 分鐘）后再丟棄（避免腦膜炎球菌擴(kuò)散，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)室感染）；
生物安全柜內(nèi)的耗材（如接種環(huán)、吸管）需滅菌后處理，臺(tái)面用 0.5% 含氯消毒劑擦拭消毒。
2、質(zhì)量控制驗(yàn)證
陽(yáng)性對(duì)照：18~24 小時(shí)應(yīng)在巧克力平板和改良 TM 平板上長(zhǎng)出典型“露滴狀”菌落，氧化酶陽(yáng)性，發(fā)酵葡萄糖和麥芽糖；
陰性對(duì)照：在改良 TM 平板上應(yīng)不生長(zhǎng)（驗(yàn)證選擇培養(yǎng)基的抑制效果），在巧克力平板上可生長(zhǎng)（但形態(tài)與腦膜炎球菌不同）；
若對(duì)照菌生長(zhǎng)異常，需排查培養(yǎng)基質(zhì)量（如巧克力培養(yǎng)基是否新鮮）、培養(yǎng)箱參數(shù)（CO?濃度、溫度）是否達(dá)標(biāo)，重新進(jìn)行試驗(yàn)。
八、關(guān)鍵注意事項(xiàng)總結(jié)
標(biāo)本時(shí)效性：標(biāo)本采集后需 1 小時(shí)內(nèi)處理，全程保持 35~37℃（避免低溫導(dǎo)致細(xì)菌失活，尤其是腦脊液標(biāo)本）；
無(wú)菌操作：所有步驟在生物安全柜內(nèi)進(jìn)行，接種環(huán)需徹底滅菌，避免雜菌污染（腦膜炎球菌菌落易被雜菌覆蓋）；
環(huán)境監(jiān)控：培養(yǎng)箱的 CO?濃度和濕度需每日檢查，避免因參數(shù)波動(dòng)導(dǎo)致培養(yǎng)失敗；
鑒別要點(diǎn)：需與淋病奈瑟菌嚴(yán)格區(qū)分（核心是麥芽糖發(fā)酵試驗(yàn)，腦膜炎球菌陽(yáng)性，淋病奈瑟菌陰性），避免誤診。
通過(guò)以上流程，可實(shí)現(xiàn)腦膜炎球菌的高效分離與初步鑒定，為臨床診斷和流行病學(xué)調(diào)查提供關(guān)鍵依據(jù)。
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