屎腸球菌選擇性培養(yǎng)基的核心原理與常用類型及注意事項！
小楊 / 2025-10-13 10:01:55
屎腸球菌（Enterococcus faecium）是腸球菌屬的重要成員，廣泛存在于腸道及自然環(huán)境中，部分菌株因耐藥性成為臨床重要條件致病菌。其選擇性培養(yǎng)依賴“營養(yǎng)供給 + 抑制雜菌 + 菌株鑒別”的三重設計，核心是利用腸球菌的生理特性排除其他微生物干擾，同時通過生化反應區(qū)分屎腸球菌與其他腸球菌（如
糞腸球菌）。
一、屎腸球菌選擇性培養(yǎng)基的核心原理
屎腸球菌的選擇性培養(yǎng)基于其獨特的生物學特性，培養(yǎng)基通過以下 3 個關鍵設計實現(xiàn)選擇性：
1、營養(yǎng)基礎：滿足腸球菌生長需求
腸球菌為兼性厭氧革蘭氏陽性球菌，營養(yǎng)需求中等，培養(yǎng)基需提供基礎碳源、氮源和生長因子：
碳源：葡萄糖、乳糖等（部分培養(yǎng)基含蔗糖，利用腸球菌的發(fā)酵特性鑒別）；
氮源：胰蛋白胨、大豆蛋白胨等，提供氨基酸和多肽；
生長因子：酵母提取物補充 B 族維生素，促進腸球菌快速繁殖。
2、抑制成分：排除雜菌干擾
腸道及環(huán)境樣本中含大量革蘭氏陰性菌（如
大腸埃希菌）、真菌及其他革蘭氏陽性菌（如
葡萄球菌），需通過以下成分抑制：
抑制成分 作用機制 抑制對象
膽鹽/去氧膽酸鈉 破壞革蘭氏陰性菌的細胞膜（革蘭氏陽性菌因細胞壁厚、脂質少，耐受度更高） 絕大多數(shù)革蘭氏陰性菌（如大腸埃希菌、變形桿菌）
疊氮鈉（NaN?） 抑制細胞色素氧化酶，阻斷有氧呼吸（腸球菌可通過發(fā)酵供能，耐受低濃度疊氮鈉） 需氧革蘭氏陽性菌（如葡萄球菌、鏈球菌）、真菌
萬古霉素（可選） 抑制細菌細胞壁合成（僅用于篩選耐萬古霉素屎腸球菌 VRE，敏感菌被抑制） 萬古霉素敏感菌（如糞腸球菌、葡萄球菌）
亞碲酸鉀（可選） 抑制雜菌，腸球菌可還原亞碲酸鉀為黑色單質碲，輔助鑒別 大部分革蘭氏陰性菌及部分陽性菌
3、鑒別成分：區(qū)分屎腸球菌與其他腸球菌
腸球菌屬內（如
屎腸球菌、
糞腸球菌）的鑒別依賴生化反應差異，核心是利用屎腸球菌的特定酶活性或發(fā)酵特性：
β- 葡萄糖苷酶：
屎腸球菌可產生 β- 葡萄糖苷酶，水解培養(yǎng)基中的七葉苷生成葡萄糖和七葉素；七葉素再與培養(yǎng)基中的檸檬酸鐵銨反應，生成黑色的鐵 - 七葉素復合物，使菌落周圍出現(xiàn)黑色暈圈（腸球菌屬通用鑒別特征，可排除非腸球菌）。
甘露醇/山梨醇發(fā)酵：
部分選擇性培養(yǎng)基含甘露醇：屎腸球菌可發(fā)酵甘露醇產酸，使培養(yǎng)基 pH 降低，指示劑由紅變黃；而糞腸球菌不發(fā)酵甘露醇，菌落周圍仍為紅色，實現(xiàn)種間區(qū)分。
色素或特殊指示劑：
部分商用培養(yǎng)基含 chromogenic 底物，屎腸球菌可分解底物釋放特定顏色（如紫色），直接通過菌落顏色鑒別，無需額外生化試驗。
二、常用屎腸球菌選擇性培養(yǎng)基類型
不同培養(yǎng)基的設計側重不同（如常規(guī)分離 vs VRE 篩選），需根據實驗目的選擇：
培養(yǎng)基名稱 核心成分 用途 屎腸球菌菌落特征
疊氮鈉 - 七葉苷瓊脂 疊氮鈉、七葉苷、檸檬酸鐵銨 常規(guī)腸球菌分離與鑒別 灰白色菌落，周圍有黑色暈圈
甘露醇 - 疊氮鈉瓊脂 疊氮鈉、甘露醇、酚紅 區(qū)分屎腸球菌與糞腸球菌 黃色菌落（發(fā)酵甘露醇），周圍培養(yǎng)基變黃
ChromID VRE 瓊脂 萬古霉素、chromogenic 底物 篩選耐萬古霉素屎腸球菌（VRE） 紫色菌落（分解底物）
膽汁 - 七葉苷 - 疊氮鈉瓊脂 膽鹽、七葉苷、疊氮鈉 強選擇性分離腸道中的腸球菌 黑色菌落（七葉素 - 鐵復合物）
三、屎腸球菌選擇性培養(yǎng)基的使用方法
以常規(guī)樣本（如糞便、食品）分離屎腸球菌為例，標準操作流程如下：
1、實驗前準備
培養(yǎng)基制備：
商用干粉培養(yǎng)基按說明書溶解（如 1000mL 蒸餾水 + 40g 干粉），加熱煮沸至完全溶解，分裝后 121℃高壓滅菌 15 分鐘；若含萬古霉素等熱敏成分，需待培養(yǎng)基冷卻至 50-55℃時無菌加入，搖勻后倒平板（厚度約 3-4mm），室溫凝固后 4℃避光保存（有效期≤1 周）。
樣本預處理（可選，針對含菌量高的樣本）：
糞便樣本需用無菌生理鹽水梯度稀釋（如 10?¹~10??），取 0.1~0.2mL 稀釋液接種，避免雜菌過度生長掩蓋目標菌落；食品樣本需均質化后按同樣方法稀釋。
2、接種與培養(yǎng)
接種方式：
劃線接種：用無菌接種環(huán)取預處理后的樣本，在培養(yǎng)基表面進行三區(qū)劃線（逐步稀釋菌量，獲得單菌落）；
涂布接種：取 0.1mL 稀釋液滴于平板中央，用無菌 L 型玻棒均勻涂布，室溫放置 5-10 分鐘待液體吸收。
培養(yǎng)條件：
腸球菌為兼性厭氧，可選擇：
需氧培養(yǎng)：35-37℃恒溫培養(yǎng)箱，培養(yǎng) 24-48 小時；
厭氧培養(yǎng)（推薦，減少需氧雜菌干擾）：35-37℃厭氧環(huán)境（如厭氧袋、厭氧培養(yǎng)箱），培養(yǎng) 24 小時（生長速度更快）。
3、菌落觀察與初步鑒別
培養(yǎng)后根據培養(yǎng)基特性判斷目標菌落，以疊氮鈉 - 七葉苷瓊脂為例：
陽性特征：菌落呈灰白色、圓形、邊緣整齊（直徑 0.5-1mm），菌落周圍或下方出現(xiàn)黑色暈圈（七葉素 - 鐵復合物）；
排除雜菌：若出現(xiàn)紅色、黃色或無黑色暈圈的菌落，多為雜菌（如
葡萄球菌、
大腸埃希菌），可直接排除。
若使用甘露醇 - 疊氮鈉瓊脂，需額外觀察：屎腸球菌菌落周圍培養(yǎng)基呈黃色（發(fā)酵甘露醇產酸），而糞腸球菌菌落周圍仍為紅色，可直接區(qū)分兩種腸球菌。
4、確認鑒定（關鍵步驟）
選擇性培養(yǎng)僅為初步篩選，需通過以下方法確認是否為屎腸球菌：
革蘭氏染色：取疑似菌落涂片，革蘭氏染色后鏡檢，應為革蘭氏陽性球菌，呈鏈狀或成雙排列（排除革蘭氏陰性菌或葡萄球菌）；
生化試驗：
觸酶試驗：陰性（區(qū)別于葡萄球菌，后者觸酶陽性）；
6.5% 氯化鈉耐受試驗：陽性（腸球菌特性，接種于含 6.5% NaCl 的肉湯，37℃培養(yǎng) 24 小時，肉湯渾濁為陽性）；
分子鑒定（金標準）：提取菌落 DNA，通過 PCR 擴增 16S rRNA 基因或屎腸球菌特異性基因，測序后與數(shù)據庫比對，確認物種。
四、注意事項
1、安全操作：
疊氮鈉為劇毒物質（抑制細胞呼吸），操作時需戴手套、口罩，避免接觸皮膚或吸入；若不慎灑落，需用次氯酸鈉溶液處理后清理；培養(yǎng)基廢棄前需 121℃高壓滅菌 30 分鐘，避免環(huán)境污染。
2、培養(yǎng)時間控制：
若培養(yǎng)時間不足 24 小時，可能未形成明顯黑色暈圈或黃色區(qū)域；超過 48 小時可能導致雜菌過度生長（如真菌），需及時觀察。
3、VRE 篩選的特殊性：
篩選耐萬古霉素屎腸球菌時，需使用含萬古霉素（濃度通常為 6μg/mL）的培養(yǎng)基，且培養(yǎng)時間需延長至 48 小時，避免漏檢緩慢生長的 VRE 菌株。
4、樣本代表性：
糞便等樣本中腸球菌含量差異大，建議同時接種 2-3 個不同稀釋度的樣本，提高分離成功率。
綜上，
屎腸球菌選擇性培養(yǎng)基的核心是“利用生理特性實現(xiàn)選擇 + 生化反應實現(xiàn)鑒別”，使用時需結合樣本類型選擇合適培養(yǎng)基，并通過生化或分子方法確認鑒定，確保結果準確。
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