營養(yǎng)肉汁瓊脂培養(yǎng)基的使用方法與作用原理及適用范圍！
小楊 / 2025-10-13 09:40:40
營養(yǎng)肉汁瓊脂培養(yǎng)基（Nutrient Broth Agar Medium，簡稱 NBA 培養(yǎng)基）是微生物學實驗室中最基礎、最常用的非選擇性固體培養(yǎng)基之一，主要用于細菌的分離培養(yǎng)、純化、計數、菌落形態(tài)觀察及菌種保存，尤其適用于營養(yǎng)需求簡單的異養(yǎng)型細菌（如
大腸桿菌、
金黃色葡萄球菌等）。其核心優(yōu)勢是成分簡單、營養(yǎng)均衡，能滿足大多數常見細菌的生長需求。以下將詳細介紹其使用方法、作用原理及關鍵注意事項。
培養(yǎng)基的功能依賴于其成分對微生物營養(yǎng)需求的滿足，NBA 培養(yǎng)基的成分圍繞細菌生長的核心需求（碳源、氮源、無機鹽、生長因子、凝固劑）設計，具體如下：
核心成分 主要來源 作用原理
碳源（能量來源） 葡萄糖、牛肉浸出物中的碳水化合物 為細菌代謝提供能量，支持其繁殖（異養(yǎng)型細菌無法自身合成碳源，需從培養(yǎng)基獲?。?。
氮源（合成蛋白質/核酸） 牛肉浸出物、蛋白胨 提供氨基酸、多肽、核苷酸等，用于細菌合成蛋白質、DNA/RNA 等關鍵生物大分子。
無機鹽 牛肉浸出物、氯化鈉 提供 Na?、K?、Ca²?、Mg²?等離子，維持細菌細胞滲透壓平衡，參與酶促反應（如 Mg²?是 DNA 聚合酶的輔酶）。
生長因子 牛肉浸出物 含維生素、微量元素等，補充細菌自身無法合成的小分子物質，促進生長。
凝固劑 瓊脂 從海藻中提取的多糖，在 95℃以上溶解、40℃以下凝固，凝固后形成固體基質，不被細菌降解（僅起支撐作用，無營養(yǎng)），使細菌在表面形成孤立菌落。
pH 緩沖 磷酸鹽（部分配方添加） 維持培養(yǎng)基 pH 穩(wěn)定在7.2-7.4（大多數細菌的最適 pH，避免 pH 波動影響細菌生長）。
NBA 培養(yǎng)基的使用需遵循“制備→滅菌→倒平板→接種→培養(yǎng)→觀察”的標準化流程，每一步均需嚴格控制無菌操作，避免雜菌污染。
1、前期準備：培養(yǎng)基制備（商品化干粉/自配）
實驗室常用商品化干粉培養(yǎng)基，操作便捷；也可根據需求自行配制，核心是確保成分溶解均勻、pH 達標。
（1）商品化干粉制備（推薦，操作簡單）
稱量：根據培養(yǎng)需求計算用量（通常 1 L 培養(yǎng)基需干粉30-35 g，具體參考產品說明書），例如：需制備 200 mL 培養(yǎng)基，稱量干粉 6-7 g。
溶解：將干粉加入相應體積的純化水（或蒸餾水，避免自來水含有的氯、雜質影響細菌生長）中，置于燒杯中，用玻璃棒攪拌至干粉完全溶解（可輕微加熱至 50-60℃加速溶解，避免劇烈煮沸導致成分破壞）。
pH 調節(jié)：用 pH 計或精密 pH 試紙檢測溶液 pH，若偏離 7.2-7.4，用1 mol/L NaOH（調 pH 升高）或1 mol/L HCl（調 pH 降低）緩慢校正，邊加邊攪拌，避免 pH 驟變。
定容：若溶解過程中水分蒸發(fā)，需補加純化水至目標體積，確保濃度準確。
（2）自行配制（需單獨準備原料）
傳統(tǒng)配方（1 L）：牛肉浸出物 3 g、蛋白胨 10 g、氯化鈉 5 g、瓊脂 15-20 g、純化水 1 L。操作步驟與干粉制備一致：先將牛肉浸出物、蛋白胨、氯化鈉溶于水中，再加入瓊脂加熱溶解，調節(jié) pH 后定容。
2、關鍵步驟：滅菌（確保無菌，避免污染）
未滅菌的培養(yǎng)基含大量雜菌，必須通過高壓蒸汽滅菌法徹底殺滅微生物（包括芽孢），是實驗成功的核心環(huán)節(jié)。
分裝：將溶解好的培養(yǎng)基倒入錐形瓶（體積不超過錐形瓶容積的 2/3，避免滅菌時溢出），瓶口用雙層牛皮紙或硅膠塞密封（透氣且防污染），貼上標簽（注明培養(yǎng)基名稱、配制日期、操作者）。
滅菌條件：將錐形瓶放入高壓蒸汽滅菌鍋，設定參數：121℃、103.4 kPa（1 atm）、滅菌 20-30 分鐘（若培養(yǎng)基體積 > 500 mL，需延長至 30-40 分鐘，確保內部達到滅菌溫度）。
冷卻與保溫：滅菌結束后，關閉滅菌鍋，待壓力降至 0 kPa、溫度降至 100℃以下時，緩慢打開排氣閥，取出錐形瓶。若需立即倒平板，將錐形瓶置于50-60℃水浴鍋中保溫（避免瓊脂凝固）；若暫不使用，可室溫冷卻至凝固后，4℃冰箱保存（保質期 1-2 周）。
3、倒平板（制備固體培養(yǎng)載體）
“倒平板”是將液態(tài)培養(yǎng)基轉化為固體平板的過程，需在超凈工作臺（無菌環(huán)境）中操作，防止空氣中的雜菌落入。
工作臺消毒：打開超凈工作臺的紫外燈，照射 30 分鐘滅菌；關閉紫外燈，開啟風機，用 75% 乙醇擦拭工作臺面、錐形瓶外壁及操作者雙手（或戴無菌手套）。
倒平板操作：
取無菌培養(yǎng)皿（直徑 90 mm 或 60 mm），在工作臺內打開皿蓋（僅打開一條縫隙，避免暴露時間過長）；
手持錐形瓶，瓶口靠近火焰（通過火焰滅菌，防止瓶口雜菌污染），緩慢將培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿中，每皿倒入15-20 mL（厚度約 3-5 mm，過厚影響菌落觀察，過薄易干裂）；
倒完后，輕輕晃動培養(yǎng)皿，使培養(yǎng)基均勻覆蓋皿底，避免產生氣泡；
蓋上皿蓋，待培養(yǎng)基自然冷卻至室溫（約 30-60 分鐘，瓊脂完全凝固），即為“營養(yǎng)肉汁瓊脂平板”。
平板保存：若暫不接種，將平板倒置（皿蓋在下、皿底在上，避免冷凝水滴落污染培養(yǎng)基表面），放入 4℃冰箱保存，使用前需室溫平衡 30 分鐘（避免低溫影響細菌生長）。
4、接種與培養(yǎng)（實現細菌分離與增殖）
根據實驗目的（如分離、純化、計數）選擇不同的接種方法，核心是通過無菌操作將待檢樣品（如土壤、水、食品、臨床樣本）中的細菌轉移至平板上。
（1）常用接種方法
接種方法 適用場景 操作要點
劃線分離法 從混合樣品中分離單菌落（純化菌種） 用無菌接種環(huán)蘸取少量樣品，在平板表面按“分區(qū)劃線”，每劃完一區(qū)后灼燒接種環(huán)滅菌，逐步稀釋細菌，最終形成孤立菌落。
涂布分離法 細菌計數（菌落數對應樣品中細菌濃度） 取 0.1-0.2 mL 稀釋后的樣品，滴在平板中央，用無菌涂布器將樣品均勻涂抹在培養(yǎng)基表面，避免樣品堆積。
點種法 快速觀察多個樣品的生長情況（如菌種篩選） 用無菌接種針蘸取少量樣品，在平板上按點狀接種（每點間隔 1-2 cm），無需涂抹，直接培養(yǎng)。
（2）培養(yǎng)條件
溫度：大多數常見細菌（如
大腸桿菌、
枯草芽孢桿菌）的最適生長溫度為37℃，置于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；若為嗜冷菌（如某些海洋細菌），需 20-25℃培養(yǎng)；嗜熱菌需 45-55℃培養(yǎng)。
時間：根據細菌生長速度調整，一般培養(yǎng)18-24 小時（大多數細菌可形成清晰菌落）；若為慢生長菌（如
結核分枝桿菌），需延長至數天甚至數周。
氣體環(huán)境：需區(qū)分細菌的需氧類型：
需氧菌/兼性厭氧菌（如
金黃色葡萄球菌）：直接置于有氧培養(yǎng)箱中；
厭氧菌（如
破傷風梭菌）：需放入厭氧培養(yǎng)罐（或厭氧工作站），通入氮氣/二氧化碳排除氧氣。
5、結果觀察與后續(xù)處理
培養(yǎng)結束后，取出平板，觀察并記錄菌落形態(tài)（如大小、形狀、顏色、邊緣、表面光滑度、是否產色素等），后續(xù)可根據實驗目的進行進一步操作：
純化菌種：挑取形態(tài)典型的單菌落，接種至新鮮的營養(yǎng)肉汁瓊脂平板或營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，再次培養(yǎng)，獲得純培養(yǎng)物；
計數：對于涂布法接種的平板，選擇菌落數在30-300 個的平板（菌落數過多易重疊，過少誤差大），計算樣品中的細菌濃度（公式：細菌濃度（CFU/mL）= 平板菌落數 × 稀釋倍數 / 接種體積）；
菌種保存：將純培養(yǎng)物接種至斜面培養(yǎng)基（營養(yǎng)肉汁瓊脂斜面），培養(yǎng)后 4℃保存（短期保存，1-3 個月）；或用甘油管冷凍保存（-80℃，長期保存）。
三、關鍵注意事項與常見問題解決
1、無菌操作是核心：
所有操作（倒平板、接種）必須在超凈工作臺中進行，避免手、空氣、器具帶來的雜菌污染；
接種環(huán)、涂布器等器具需通過火焰滅菌（確保整個金屬部分燒至紅熱），冷卻后再使用（避免高溫殺死待接種細菌）。
2、瓊脂凝固與平板質量：
倒平板時培養(yǎng)基溫度需控制在 50-60℃（溫度過高會燙壞培養(yǎng)皿，過低易提前凝固導致平板不均）；
若平板出現氣泡，可在瓊脂未完全凝固前用無菌針頭挑破；若平板表面干裂，不可使用（影響細菌生長）。
3、pH 調節(jié)的重要性：
培養(yǎng)基 pH 偏離 7.2-7.4 會顯著影響細菌生長（如 pH 過低抑制革蘭氏陰性菌，過高抑制革蘭氏陽性菌），必須嚴格校正；
滅菌后 pH 可能會略有下降（約 0.1-0.2），可在滅菌前將 pH 調至 7.4-7.5，補償滅菌后的下降。
4、常見問題與解決方案：
平板無菌落生長：可能原因：①待檢樣品中無活菌；②接種操作失誤（如接種環(huán)未冷卻、樣品稀釋過度）；③培養(yǎng)條件不當（如溫度錯誤、厭氧菌未厭氧培養(yǎng)）。需逐一排查。
菌落過多且重疊：原因是樣品稀釋度不夠，需增加稀釋倍數（如從 10??調整為 10??）后重新接種。
雜菌污染（出現非目標菌落）：原因是無菌操作不嚴格，需重新消毒工作臺、滅菌器具，更換培養(yǎng)基后重試。
四、適用范圍與局限性
1、適用范圍
常規(guī)細菌的分離、純化、計數（如環(huán)境樣品、食品樣品中的細菌檢測）；
細菌菌落形態(tài)觀察與初步鑒定（不同細菌的菌落形態(tài)有特征性，可作為初步區(qū)分依據）；
菌種的短期保存與活化（斜面培養(yǎng)基）。
2、局限性
非選擇性：無法區(qū)分目標菌與雜菌（如檢測食品中的
沙門氏菌時，NBA 培養(yǎng)基會同時培養(yǎng)其他雜菌，需使用選擇性培養(yǎng)基如 SS 瓊脂）；
營養(yǎng)簡單：無法滿足營養(yǎng)需求復雜的細菌（如乳酸菌需添加乳糖、維生素，結核分枝桿菌需添加雞蛋黃、甘油），需使用專用培養(yǎng)基。
綜上，
營養(yǎng)肉汁瓊脂培養(yǎng)基是微生物實驗室的“基礎工具”，其使用需嚴格遵循無菌操作和標準化流程，核心是通過均衡的營養(yǎng)和固體基質支持細菌生長，為后續(xù)的微生物分離、鑒定和研究提供基礎。
北京百歐博偉生物技術有限公司擁有對菌種、細胞、培養(yǎng)基、配套試劑等產品需求者的極優(yōu)質服務，對購買項目的前期資料提供,中期合同保證,后期貨物跟蹤到最終售后的確保項目準確到位，都有相關人士進行維護,確保您在
微生物菌種查詢網中獲得最優(yōu)質服務！也正因為此，北京百歐博偉生物技術有限公司與國內外多家研制單位、生物制藥、第三方檢測機構和科研院所院校、化工企業(yè)有著良好、長期和穩(wěn)定的合作關系！
下載附件
上一篇：沙門氏菌生化鑒定條及成套生化鑒定管的原理與使用方法！
下一篇：屎腸球菌選擇性培養(yǎng)基的核心原理與常用類型及注意事項！