陰溝腸桿菌分離瓊脂（ECIA）培養(yǎng)基配制的具體步驟！
小楊 / 2025-10-22 09:13:13
陰溝腸桿菌分離瓊脂（ECIA）培養(yǎng)基的配制需嚴(yán)格遵循配方比例和無(wú)菌操作，以確保其選擇性和鑒別性能。以下是具體配制步驟，包括原料準(zhǔn)備、溶解、滅菌、分裝及質(zhì)量控制等關(guān)鍵環(huán)節(jié)：
一、配方參考（以 1L 培養(yǎng)基為例）
ECIA 的核心成分包括營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、選擇性抑制劑、鑒別底物及指示劑，典型配方如下（可根據(jù)實(shí)際需求調(diào)整）：
成分 含量（g/L） 作用
蛋白胨 10.0 提供碳源、氮源和生長(zhǎng)因子
牛肉浸粉 3.0 補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng)，促進(jìn)細(xì)菌生長(zhǎng)
乳糖 5.0 碳水化合物來(lái)源，部分菌株可分解
鄰硝基苯 -β-D - 半乳糖苷 0.3 鑒別 β- 半乳糖苷酶，陽(yáng)性者產(chǎn)生黃色產(chǎn)物
L - 鳥(niǎo)氨酸鹽酸鹽 5.0 鑒別鳥(niǎo)氨酸脫羧酶，陽(yáng)性者產(chǎn)生堿性物質(zhì)，使指示劑變色
膽鹽（或去氧膽酸鈉） 1.5 抑制革蘭氏陽(yáng)性菌及部分非目標(biāo)革蘭氏陰性菌
頭孢他啶 0.02 選擇性抑制其他腸桿菌科細(xì)菌，保留陰溝腸桿菌（耐藥性）
酚紅 0.02 pH 指示劑（酸性變黃，堿性變紅）
瓊脂 15.0 凝固劑，使培養(yǎng)基呈固態(tài)
蒸餾水 1000mL 溶解上述成分
二、具體配制步驟
1、準(zhǔn)備工作
器具滅菌：錐形瓶、燒杯、玻璃棒、試管、培養(yǎng)皿等需經(jīng) 121℃高壓滅菌 20 分鐘，或干熱滅菌（160℃，2 小時(shí)）。
試劑檢查：確認(rèn)各成分（尤其是 ONPG、頭孢他啶等敏感試劑）在有效期內(nèi)，無(wú)潮解、變質(zhì)。
安全防護(hù)：佩戴手套、口罩，在生物安全柜或無(wú)菌操作臺(tái)內(nèi)操作。
2、溶解與調(diào) pH
稱(chēng)量與溶解：
按配方準(zhǔn)確稱(chēng)量蛋白胨、牛肉浸粉、乳糖、鳥(niǎo)氨酸鹽酸鹽、膽鹽、酚紅、瓊脂，加入 900mL 蒸餾水中。
玻璃棒攪拌均勻，置于磁力攪拌器上加熱至沸騰（避免糊底），使瓊脂完全溶解（溶液澄清）。
加入 ONPG（需先用少量溫水溶解后再倒入，避免直接加熱破壞），補(bǔ)足蒸餾水至 1000mL。
調(diào)節(jié) pH：
待溶液冷卻至 50-60℃時(shí)，用 1mol/L HCl 或 NaOH 調(diào)節(jié) pH 至7.2±0.2（用 pH 計(jì)或精密 pH 試紙檢測(cè)）。此時(shí)溶液因酚紅呈橙紅色（中性偏堿）。
3、加入選擇性抗生素
頭孢他啶等抗生素需在滅菌后、培養(yǎng)基冷卻至 50-55℃時(shí)加入（避免高溫破壞抗生素活性）：
用無(wú)菌水或生理鹽水溶解頭孢他啶（濃度為 20mg/mL），經(jīng) 0.22μm 濾膜過(guò)濾除菌（抗生素不可高壓滅菌）。
按比例（1L 培養(yǎng)基加 1mL 上述溶液）加入冷卻后的培養(yǎng)基中，輕輕混勻（避免產(chǎn)生氣泡）。
4、分裝與滅菌
分裝：將溶液分裝至錐形瓶（每瓶約 200mL，便于倒平板），或直接分裝至滅菌試管（若需制備斜面）。
滅菌：121℃高壓蒸汽滅菌 15 分鐘（注意：滅菌時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)破壞 ONPG 和抗生素，需嚴(yán)格控制）。
排氣：滅菌結(jié)束后，緩慢釋放蒸汽，避免培養(yǎng)基暴沸。
5、倒平板
滅菌后，待培養(yǎng)基冷卻至 50-55℃（手感微燙但不燙手），在無(wú)菌操作臺(tái)內(nèi)倒平板：
每培養(yǎng)皿（直徑 90mm）倒入約 15-20mL 培養(yǎng)基，確保厚度均勻。
輕輕晃動(dòng)培養(yǎng)皿，使培養(yǎng)基鋪滿(mǎn)底部，避免產(chǎn)生氣泡。
水平放置，待凝固（約 30 分鐘）。
6、質(zhì)量控制
無(wú)菌試驗(yàn)：取 1-2 個(gè)平板，35-37℃培養(yǎng) 24 小時(shí)，若無(wú)菌落生長(zhǎng)，說(shuō)明滅菌合格。
性能驗(yàn)證：
陽(yáng)性對(duì)照：接種已知陰溝腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)株（如
ATCC 13047），培養(yǎng)后應(yīng)形成典型黃色/橙紅色菌落。
陰性對(duì)照：接種大腸桿菌（如
ATCC 25922），應(yīng)生長(zhǎng)受抑制或形成非特征性菌落。
合格后，標(biāo)記培養(yǎng)基名稱(chēng)、配制日期，2-8℃避光保存，保質(zhì)期 1 個(gè)月。
三、注意事項(xiàng)
ONPG 穩(wěn)定性：ONPG 對(duì)光和熱敏感，需避光保存，溶解時(shí)水溫不超過(guò) 50℃，避免分解失效。
抗生素添加時(shí)機(jī)：必須在培養(yǎng)基冷卻后加入（50-55℃），溫度過(guò)高會(huì)破壞抗生素，過(guò)低則培養(yǎng)基凝固，無(wú)法混勻。
瓊脂濃度：瓊脂含量不足會(huì)導(dǎo)致培養(yǎng)基過(guò)軟，過(guò)高則過(guò)硬，影響細(xì)菌生長(zhǎng)，需準(zhǔn)確稱(chēng)量。
污染控制：倒平板時(shí)若發(fā)現(xiàn)氣泡，可用無(wú)菌吸管刺破；若有雜菌污染，整批培養(yǎng)基需廢棄。
個(gè)性化調(diào)整：若需提高選擇性，可適當(dāng)增加頭孢他啶濃度（但需預(yù)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，避免抑制目標(biāo)菌）。
通過(guò)以上步驟，可配制出性能穩(wěn)定的
ECIA 培養(yǎng)基，為陰溝腸桿菌的分離鑒別提供可靠支持。實(shí)際操作中，也可選擇商品化干粉培養(yǎng)基，簡(jiǎn)化流程并保證一致性。
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