豬原代骨骼肌成纖維細(xì)胞分離培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備與具體步驟！
小楊 / 2025-10-23 09:03:34
豬原代骨骼肌成纖維細(xì)胞的分離培養(yǎng)是獲取高純度、功能完整細(xì)胞的關(guān)鍵步驟，需嚴(yán)格遵循無(wú)菌操作，結(jié)合酶解或組織塊法分離，并通過(guò)純化確保細(xì)胞純度。以下是詳細(xì)步驟：
一、實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備
1、材料與試劑
取材材料：健康仔豬（建議 2-4 周齡，肌肉組織活力高）的骨骼?。ㄈ绫巢孔铋L(zhǎng)肌、腿部股四頭肌），重量約 5-10g；
基礎(chǔ)試劑：
緩沖液：PBS（含 100U/mL 青霉素、100μg/mL 鏈霉素，即“雙抗”），用于清洗組織；
培養(yǎng)基：DMEM 高糖培養(yǎng)基，添加 10%-20% 胎牛血清（FBS，需提前篩選無(wú)支原體批次）、1% 雙抗，4℃保存；
消化酶：0.25% 胰蛋白酶 - EDTA（用于分散細(xì)胞）、Ⅰ 型膠原酶（2mg/mL，用于分解肌肉組織間質(zhì)）；
其他：75% 酒精、無(wú)菌手術(shù)器械（剪刀、鑷子、培養(yǎng)皿、離心管、200 目細(xì)胞篩等）。
2、無(wú)菌環(huán)境與設(shè)備
超凈工作臺(tái)（紫外消毒 30 分鐘，通風(fēng)后使用）；
37℃恒溫水浴鍋、37℃、5% CO?培養(yǎng)箱（提前校準(zhǔn)濕度和氣體濃度）；
離心機(jī)（室溫，轉(zhuǎn)速可調(diào)節(jié)至 1000r/min）。
二、具體步驟
步驟 1：組織取材與預(yù)處理（無(wú)菌操作）
取材：無(wú)菌條件下分離豬骨骼肌組織，迅速放入含雙抗的 PBS 中（冰浴運(yùn)輸，避免細(xì)胞缺氧損傷）；
清洗去雜：
將組織轉(zhuǎn)移至超凈臺(tái)內(nèi)的無(wú)菌培養(yǎng)皿中，用含雙抗的 PBS 沖洗 3-5 次，直至沖洗液無(wú)血色（去除血液中的紅細(xì)胞和雜質(zhì)）；
用無(wú)菌鑷子剔除組織表面的脂肪、筋膜、血管等結(jié)締組織（這些組織會(huì)導(dǎo)致成纖維細(xì)胞純度降低）。
步驟 2：組織剪碎
用無(wú)菌剪刀將清洗后的肌肉組織剪成 1mm³ 左右的小塊（越小越利于后續(xù)酶解），期間不斷用 PBS 沖洗，直至組織塊邊緣無(wú)血跡；
將剪碎的組織塊轉(zhuǎn)移至 50mL 離心管中，加 10mL 含雙抗的 PBS，輕輕顛倒混勻，1000r/min 離心 5 分鐘，棄上清（去除殘留雜質(zhì)）。
步驟 3：酶解分離單細(xì)胞（常用方法，效率高于組織塊法）
膠原酶消化：
向組織塊中加入 10-15mL Ⅰ 型膠原酶溶液（2mg/mL），37℃恒溫水浴中振蕩消化 30-60 分鐘（每隔 10 分鐘輕輕顛倒離心管，觀察組織塊是否分散）；
消化終點(diǎn)：組織塊明顯變小，溶液呈渾濁狀（提示細(xì)胞游離）。
終止與過(guò)濾：
加入等體積含 10% FBS 的培養(yǎng)基（終止膠原酶活性），用移液槍輕輕吹打 10-15 次（使細(xì)胞團(tuán)分散）；
將混合液通過(guò) 200 目細(xì)胞篩過(guò)濾至新的 50mL 離心管中（去除未消化的組織碎片），1000r/min 離心 5 分鐘，棄上清。
重懸細(xì)胞：
沉淀中加入 5-10mL 完全培養(yǎng)基（含 10% FBS+1% 雙抗的 DMEM），輕輕吹打制成單細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)細(xì)胞濃度（用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板，活細(xì)胞率需≥90%）。
步驟 4：原代培養(yǎng)（接種與貼壁）
按 2×10?-5×10?個(gè)細(xì)胞 /mL 的密度接種至 T25 或 T75 培養(yǎng)瓶中，輕輕搖晃使細(xì)胞均勻分布；
放入 37℃、5% CO?培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，24 小時(shí)內(nèi)不換液（避免未貼壁細(xì)胞被沖走）；
培養(yǎng) 24-48 小時(shí)后，在倒置顯微鏡下觀察：成纖維細(xì)胞開(kāi)始貼壁，呈梭形或紡錘形，少量細(xì)胞開(kāi)始伸展。
步驟 5：換液與純化（去除雜細(xì)胞）
首次換液：培養(yǎng) 48 小時(shí)后，吸出舊培養(yǎng)基（含未貼壁細(xì)胞、死細(xì)胞及代謝廢物），用 PBS 輕輕沖洗 1-2 次，加入新鮮完全培養(yǎng)基；
差速貼壁純化：若存在少量圓形雜細(xì)胞，可利用成纖維細(xì)胞貼壁快的特性：
當(dāng)細(xì)胞匯合度達(dá) 50% 時(shí)，消化后收集細(xì)胞懸液，接種至新培養(yǎng)瓶，靜置 1-2 小時(shí)；
成纖維細(xì)胞已貼壁，而雜細(xì)胞多未貼壁，吸出上清（含雜細(xì)胞），保留貼壁細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)，重復(fù) 1-2 次可提高純度。
步驟 6：傳代培養(yǎng)（擴(kuò)大細(xì)胞數(shù)量）
當(dāng)細(xì)胞匯合度達(dá) 80%-90% 時(shí)（避免過(guò)度匯合導(dǎo)致接觸抑制），進(jìn)行傳代：
吸出舊培養(yǎng)基，用 PBS 沖洗 2 次（去除殘留血清，避免影響胰酶活性）；
加入 2-3mL 0.25% 胰蛋白酶 - EDTA，37℃培養(yǎng)箱中孵育 2-5 分鐘（顯微鏡下觀察細(xì)胞變圓、間隙增大時(shí)終止）；
加入等體積含血清的培養(yǎng)基終止消化，輕輕吹打瓶壁使細(xì)胞脫落，收集懸液 1000r/min 離心 5 分鐘；
沉淀用新鮮培養(yǎng)基重懸，按 1:2-1:3 比例接種至新培養(yǎng)瓶，標(biāo)記傳代次數(shù)（原代記為 P0，傳代后依次為 P1、P2 等）。
步驟 7：細(xì)胞鑒定（確保純度）
形態(tài)學(xué)鑒定：倒置顯微鏡下觀察，成纖維細(xì)胞呈典型長(zhǎng)梭形，排列呈放射狀或漩渦狀，無(wú)上皮樣或圓形細(xì)胞；
免疫熒光染色：檢測(cè)特異性標(biāo)志物波形蛋白陽(yáng)性，肌細(xì)胞標(biāo)志物陰性，確認(rèn)純度≥95%。
三、關(guān)鍵注意事項(xiàng)
無(wú)菌控制：所有操作在超凈臺(tái)內(nèi)進(jìn)行，器械需高壓滅菌，試劑避免反復(fù)凍融，定期檢測(cè)培養(yǎng)基是否污染；
消化時(shí)間：酶解過(guò)度會(huì)損傷細(xì)胞（導(dǎo)致貼壁率下降），不足則細(xì)胞產(chǎn)量低，需根據(jù)組織狀態(tài)靈活調(diào)整；
血清質(zhì)量：FBS 是成纖維細(xì)胞增殖的關(guān)鍵，建議選擇批次穩(wěn)定的優(yōu)質(zhì)血清，首次使用前需做生長(zhǎng)曲線驗(yàn)證；
傳代限制：原代細(xì)胞傳代至 5-10 代后增殖能力下降，實(shí)驗(yàn)建議使用 P3-P5 代細(xì)胞，避免功能退化。
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