培養(yǎng)基的傾倒方法與操作步驟及常見問題與解決措施！
小楊 / 2025-10-28 09:47:30
百歐博偉生物：培養(yǎng)基的傾倒（倒平板）是微生物學(xué)實驗中最基本也最關(guān)鍵的操作之一。其核心目的是在無菌條件下，將熔化的瓊脂培養(yǎng)基倒入無菌培養(yǎng)皿中，制成均勻、平整的固體培養(yǎng)基平面，用于微生物的分離、純化和培養(yǎng)。以下是詳細的方法、步驟及注意事項。
一、實驗前準備
1、儀器與材料：
已滅菌的瓊脂培養(yǎng)基（在試管或錐形瓶中）
無菌培養(yǎng)皿
恒溫水浴鍋（設(shè)置為45-50°C）
超凈工作臺或酒精燈（提供無菌環(huán)境）
75%酒精棉球
記號筆
試管架或瓶架
高溫手套或毛巾
2、培養(yǎng)基預(yù)處理：
將已滅菌但已凝固的瓊脂培養(yǎng)基（如放在試管或錐形瓶中的）進行加熱熔化，通常采用水浴加熱或微波爐加熱（需注意安全，防止爆沸）。
關(guān)鍵步驟：將完全熔化的培養(yǎng)基置于 45-50°C 的恒溫水浴鍋 中保溫。這個溫度高于瓊脂的凝固點（約40°C），可以保持培養(yǎng)基為液態(tài)；同時又遠低于會燙死大多數(shù)微生物的溫度，便于后續(xù)操作。用手背觸碰盛有培養(yǎng)基的容器，感覺溫?zé)岬粻C手即可。
3、環(huán)境準備：
用75%酒精擦拭超凈工作臺臺面及所有需要放入的物品表面。
開啟超凈工作臺紫外燈滅菌20-30分鐘，然后關(guān)閉紫外燈，打開風(fēng)機和照明，等待10分鐘讓氣流穩(wěn)定。
二、傾倒平板步驟（在無菌環(huán)境下操作）
1、手部消毒與物品擺放
用肥皂洗手后，用75%酒精對手部進行消毒。
將所有所需物品（已熔化的培養(yǎng)基、無菌培養(yǎng)皿等）有序地放入超凈工作臺內(nèi)。
2、點燃酒精燈
在超凈工作臺內(nèi)點燃酒精燈。其產(chǎn)生的上升熱氣流可以形成一個相對無菌的區(qū)域，操作應(yīng)在火焰附近進行。
3、取拿培養(yǎng)基
用一只手（如左手）的掌心托住培養(yǎng)基試管或錐形瓶的底部，用手指夾住培養(yǎng)皿。
另一只手（如右手）旋松試管帽或瓶蓋。
4、開啟容器（無菌操作核心）
將試管口或瓶口迅速通過酒精燈火焰2-3次，以殺滅可能附著的雜菌。
用右手的小指和手掌魚際肌夾住試管帽或瓶蓋并拔出。拔出的蓋子/塞子應(yīng)始終朝向火焰方向，不得隨意放置或接觸臺面。
5、開啟培養(yǎng)皿與傾倒
用左手將培養(yǎng)皿的蓋揭開一條縫，大小剛好能容納試管口或瓶口伸入。切勿完全打開培養(yǎng)皿，暴露在空氣中的面積越小越好。
將已開啟的試管口或瓶口再次通過火焰灼燒后，迅速從培養(yǎng)皿蓋的縫隙伸入。
將適量（通常為12-15mL，約覆蓋皿底0.5-1cm厚）的培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿中。
傾倒技巧：傾倒時，容器口不要直接接觸培養(yǎng)皿，動作要平穩(wěn)、連續(xù)。
6、蓋蓋與冷卻
迅速抽出試管口或瓶口，再次過火，然后立即蓋回蓋子/塞子。
輕輕地將培養(yǎng)皿蓋好，平放在臺面上。
7、混勻與凝固
傾倒完成后，在培養(yǎng)基凝固前，用手輕輕地將培養(yǎng)皿在桌面上做“∞”字形或順時針、逆時針的輕微晃動，使培養(yǎng)基均勻鋪滿整個皿底。注意避免搖到皿壁上或掀開皿蓋。
靜置在水平的臺面上，待其自然凝固（約20-30分鐘）。確保臺面水平，否則平板厚度會不均勻。
8、標記與預(yù)處理
凝固后，在皿底用記號筆標記培養(yǎng)基名稱、日期、操作者姓名及樣品編號等信息。
倒置培養(yǎng)皿：將凝固好的平板倒置（蓋在下，底在上）。這樣做可以防止冷凝水珠滴落在培養(yǎng)基表面，沖散菌落。
9、質(zhì)量檢查
制成的平板應(yīng)表面平整、光滑、無氣泡、無裂紋、厚度均勻。
在使用前，應(yīng)檢查平板是否有污染（雜菌菌落）。可將平板在37°C培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)24小時，無任何菌落生長方可使用。
三、關(guān)鍵注意事項
溫度是核心：培養(yǎng)基溫度過高（>55°C）會燙死后續(xù)接種的微生物，并產(chǎn)生大量冷凝水；溫度過低（<45°C）則會在傾倒過程中提前凝固，無法形成平整的表面。
無菌是前提：所有操作必須在無菌環(huán)境下進行，嚴格遵守“火焰旁操作”的原則，避免空氣中的雜菌污染。
動作要迅速流暢：開啟容器和傾倒的過程要快，以減少培養(yǎng)基暴露在空氣中的時間。
培養(yǎng)皿干燥：如果使用玻璃培養(yǎng)皿且經(jīng)過干熱滅菌，最好預(yù)先烘干。濕的培養(yǎng)皿內(nèi)壁會產(chǎn)生大量冷凝水，影響培養(yǎng)效果。
安全第一：操作熔化的培養(yǎng)基時，要佩戴高溫手套，防止?fàn)C傷。
四、常見問題與解決
冷凝水過多：培養(yǎng)基過熱、環(huán)境濕度大或凝固時正置。解決：確保培養(yǎng)基冷卻至合適溫度，倒置凝固和培養(yǎng)。
平板不平/厚度不均：臺面不水平，或晃動不均勻。解決：確保臺面水平，并輕柔混勻。
有氣泡：傾倒時過于劇烈或從過高處傾倒。解決：沿皿壁平穩(wěn)傾倒，傾倒后可用火焰短暫灼燒表面以消除氣泡（需謹慎操作）。
污染：無菌操作不嚴格，或培養(yǎng)皿、培養(yǎng)基本身未徹底滅菌。
熟練掌握培養(yǎng)基傾倒技術(shù)是進行高質(zhì)量微生物實驗的基礎(chǔ)，需要多加練習(xí)才能做到得心應(yīng)手。
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