液體石蠟保藏法的工作原理與操作流程及質量控制與應用！
小楊 / 2025-11-14 10:11:30
百歐博偉生物：液體石蠟保藏法是微生物菌種中長期保藏的經(jīng)典方法之一，具有操作簡單、成本低、適用范圍廣等特點，尤其適用于實驗室常規(guī)菌種的保藏（保藏期通常 1-5 年，部分真菌可長達 10 年）。其核心原理是通過液體石蠟形成物理屏障，隔絕氧氣、減少水分蒸發(fā)，從而降低微生物代謝活性，實現(xiàn)菌種的長期存活。
一、核心原理
隔絕氧氣：液體石蠟（化學成分為礦物油，沸點≥300℃、純度≥99%）密度小于水，覆蓋在培養(yǎng)基表面形成均勻油層，阻斷微生物與空氣接觸，抑制需氧微生物的呼吸代謝；
保持水分：油層可防止培養(yǎng)基水分蒸發(fā)，維持微生物生長所需的濕度環(huán)境，避免細胞因脫水死亡；
降低代謝速率：缺氧、低溫（通常 4℃或室溫避光）條件下，微生物代謝酶活性降低，營養(yǎng)消耗減少，細胞進入“休眠狀態(tài)”，從而延長存活時間。
適用范圍
不適用情況：
嚴格厭氧菌（油層隔絕氧氣可能導致其過度缺氧死亡，建議采用厭氧袋或庖肉培養(yǎng)基保藏）；
需長期保藏（＞5 年）或高價值菌種（建議優(yōu)先采用冷凍干燥保藏法）。
二、詳細操作流程（標準化規(guī)程）
1、實驗準備（無菌控制關鍵步驟）
（1）試劑與材料
液體石蠟：選擇化學純或分析純，需經(jīng)滅菌處理（避免引入雜菌）；
菌種：對數(shù)生長期的純培養(yǎng)物（此時細胞活性高、抗逆性強，保藏存活率最高）；
培養(yǎng)基：斜面培養(yǎng)基（根據(jù)菌種需求選擇，如細菌用 LB 斜面、真菌用 PDA 斜面）；
器材：試管（18mm×180mm）、接種環(huán)、酒精燈、恒溫培養(yǎng)箱、高壓蒸汽滅菌鍋、無菌移液管、冰箱（4℃）。
（2）液體石蠟滅菌
分裝：將液體石蠟倒入無菌試管中，高度約 1-2cm（避免過多導致后續(xù)接種困難）；
滅菌：121℃高壓蒸汽滅菌 30min（徹底殺滅油中雜菌）；
除水：滅菌后將試管傾斜放置在 60-80℃恒溫箱中烘干 2-4h（去除油層中殘留的水蒸氣，否則易導致菌種污染或代謝異常）；
冷卻：烘干后置于無菌操作臺冷卻至室溫，備用。
（3）斜面培養(yǎng)基制備與滅菌
按配方配制斜面培養(yǎng)基（如 LB 培養(yǎng)基：胰蛋白胨 10g、酵母提取物 5g、NaCl 10g、瓊脂 15-20g、蒸餾水 1000mL，pH 7.0-7.2）；
分裝試管（每管約 5-7mL），121℃高壓蒸汽滅菌 20min；
擺斜面：滅菌后趁熱將試管傾斜，使培養(yǎng)基形成斜面（斜面長度約為試管長度的 1/2，底部留有一定空間），冷卻凝固后備用。
2、接種與保藏
（1）菌種接種
無菌操作：在無菌操作臺內，用滅菌接種環(huán)挑取對數(shù)生長期的純菌種，劃線接種于斜面培養(yǎng)基上（確保接種量適中，形成均勻菌落）；
培養(yǎng)活化：將接種后的斜面置于菌種最適溫度下培養(yǎng)（如細菌 37℃、酵母菌 28℃、霉菌 25-28℃），培養(yǎng)時間至菌落成熟（細菌 18-24h、真菌 2-5d）。
（2）加入液體石蠟
無菌操作：用無菌移液管吸取冷卻后的液體石蠟，緩慢注入成熟的菌種斜面試管中；
油層厚度：確保液體石蠟完全覆蓋斜面培養(yǎng)基表面，油層厚度約 0.5-1cm（避免培養(yǎng)基暴露在空氣中）；
密封：用無菌橡皮塞或硅膠塞密封試管（避免石蠟揮發(fā)或外界雜菌進入），標記菌種名稱、保藏日期、接種人等信息。
（3）保藏條件
短期保藏（1-2 年）：4℃冰箱避光保存（適用于大多數(shù)
細菌、
酵母菌）；
長期保藏（3-5 年）：室溫避光保存（適用于
放線菌、
霉菌，避免低溫導致油層凝固）。
三、質量控制與關鍵注意事項（提高保藏成功率）
1、無菌控制（核心中的核心）
所有器材（試管、接種環(huán)、移液管）需徹底滅菌，操作全程在無菌操作臺內進行，避免雜菌污染；
液體石蠟滅菌后需烘干除水，否則殘留水分會成為雜菌滋生的培養(yǎng)基，導致菌種污染。
2、菌種質量控制
保藏前需確保菌種為純培養(yǎng)物（可通過平板劃線分離或顯微鏡觀察確認，無雜菌污染）；
選擇對數(shù)生長期的菌種保藏，此時細胞活性高、抗逆性強，避免使用衰老期菌種（存活率低）。
3、操作細節(jié)控制
液體石蠟油層需完全覆蓋斜面培養(yǎng)基，不可留有空隙，否則空氣進入會導致微生物代謝活躍，縮短保藏期；
密封試管時需確保嚴密，避免石蠟揮發(fā)或外界空氣進入，同時防止石蠟滲漏。
4、保藏期間的質量監(jiān)控
定期復核：保藏后每 6-12 個月進行一次復蘇復核，檢查菌種的存活率、純度和生物學特性（如菌落形態(tài)、生理生化特征）是否穩(wěn)定；
復蘇方法：用無菌接種環(huán)挑取少量菌種（避開液體石蠟），接種到新鮮斜面培養(yǎng)基上，在最適溫度下培養(yǎng)，觀察菌落生長情況。
5、異常情況處理
污染：若復蘇后發(fā)現(xiàn)雜菌，需立即進行純分離（平板劃線或稀釋涂布），獲得純菌種后重新保藏；
存活率低：若復蘇后菌種生長緩慢或不生長，可能是保藏時菌種活性差、油層未完全覆蓋或保藏溫度不當，需優(yōu)化接種菌種的生長階段、調整油層厚度或更換保藏溫度。
四、菌種復蘇與復壯
1、復蘇步驟
無菌操作：打開密封的保藏試管，用滅菌接種環(huán)輕輕挑取斜面培養(yǎng)基表面的菌種（避免挑取液體石蠟，否則會影響復蘇生長）；
接種培養(yǎng)：將挑取的菌種接種到新鮮斜面培養(yǎng)基上，在最適溫度下培養(yǎng)至菌落成熟；
純度驗證：復蘇后通過平板劃線分離或顯微鏡觀察，確認菌種純度，無雜菌污染后再用于實驗或傳代保藏。
2、復壯方法
若復蘇后的菌種生物學特性發(fā)生變化（如產(chǎn)酶能力下降、菌落形態(tài)異常），需進行復壯：
連續(xù)傳代：將菌種在新鮮培養(yǎng)基上連續(xù)傳代 2-3 次，恢復其正常代謝活性；
選擇培養(yǎng)：通過篩選培養(yǎng)基（如高產(chǎn)菌株的篩選培養(yǎng)基）分離優(yōu)勢菌株，恢復其原有功能；
優(yōu)化培養(yǎng)條件：調整培養(yǎng)基配方、培養(yǎng)溫度、pH 等，促進菌種功能恢復。
五、優(yōu)缺點與應用場景
1、優(yōu)點
操作簡單：無需復雜設備（如冷凍干燥機、超低溫冰箱），實驗室常規(guī)條件即可實現(xiàn)；
成本低廉：液體石蠟、斜面培養(yǎng)基等試劑成本低，適合大規(guī)模菌種保藏；
適用范圍廣：可用于細菌、放線菌、酵母菌、霉菌等絕大多數(shù)微生物；
復蘇方便：直接挑取菌種接種即可復蘇，無需復雜處理。
2、缺點
保藏期有限：通常 1-5 年，不及冷凍干燥法（10 年以上）；
占用空間大：試管保藏需占用較多冰箱或儲存空間；
部分菌種不適用：嚴格厭氧菌、對礦物油敏感的微生物無法使用；
可能影響菌種特性：長期保藏可能導致部分菌種的代謝功能或遺傳特性發(fā)生輕微變化。
3、應用場景
實驗室常規(guī)菌種保藏（如教學實驗用菌種、科研常用菌株）；
工業(yè)生產(chǎn)中短期使用的菌種保藏（如發(fā)酵生產(chǎn)用細菌、酵母菌）；
菌種資源庫的初步保藏（為冷凍干燥保藏提供備份）。
六、與其他保藏方法的對比
保藏方法 保藏期 操作難度 成本 適用范圍
液體石蠟保藏法 1-5 年 簡單 低 細菌、放線菌、酵母菌、霉菌
冷凍干燥保藏法 10 年以上 復雜 高 絕大多數(shù)微生物（包括病毒）
超低溫冷凍保藏法（-80℃/-196℃） 5-10 年 中等 中高 動物細胞、微生物、植物細胞
斜面?zhèn)鞔２胤?nbsp; 1-3 個月 極簡單 極低 臨時保藏、菌種活化
通過以上標準化操作和質量控制，液體石蠟保藏法可有效實現(xiàn)微生物菌種的中長期穩(wěn)定保藏，滿足實驗室科研、教學及工業(yè)生產(chǎn)的常規(guī)需求。若需長期保藏高價值菌種，建議結合冷凍干燥保藏法進行雙重保藏，確保菌種資源的安全性和穩(wěn)定性。
北京百歐博偉生物技術有限公司擁有Biolog微生物鑒定系統(tǒng)，超低溫冰箱，生物安全柜等儀器設備可進行對微生物分離、鑒定等常規(guī)的分子實驗研究。對我國生命科學研究、生物技術創(chuàng)新和產(chǎn)業(yè)發(fā)展的需求進行積極的面對社會乃至國外收集保藏提供微生物菌種資源。在保證生物安全和保護知識產(chǎn)權的前提下，為工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)、衛(wèi)生健康、環(huán)境保護、科研教育提供微生物物種資源、基因資源、信息資源和專業(yè)技術服務。
除此之外，我們還擁有對菌種、細胞、培養(yǎng)基、配套試劑等產(chǎn)品需求者的極優(yōu)質服務，對購買項目的前期資料提供,中期合同保證,后期貨物跟蹤到最終售后的確保項目準確到位，都有相關人士進行維護,確保您在
微生物菌種查詢網(wǎng)中獲得最優(yōu)質服務！也正因為此，北京百歐博偉生物技術有限公司與國內外多家研制單位、生物制藥、第三方檢測機構和科研院所院校、化工企業(yè)有著良好、長期和穩(wěn)定的合作關系！
下載附件
上一篇：培養(yǎng)基制備實驗過程中如何保證其營養(yǎng)成分的完整性？
下一篇：活死細胞染色實驗全攻略：手把手教你獲得完美結果！