活死細(xì)胞染色實(shí)驗(yàn)全攻略：手把手教你獲得完美結(jié)果！
小楊 / 2025-11-14 10:18:42
百歐博偉生物：在細(xì)胞生物學(xué)研究中，活死細(xì)胞染色是評(píng)估細(xì)胞活力的經(jīng)典方法。今天，我們就來(lái)詳細(xì)解析這一實(shí)驗(yàn)的全流程，幫你避開(kāi)那些常見(jiàn)的“坑”。
一、實(shí)驗(yàn)前期準(zhǔn)備
1、操作臺(tái)準(zhǔn)備
超凈臺(tái)紫外照射30分鐘充分滅菌后，關(guān)閉紫外燈，打開(kāi)風(fēng)機(jī)，通風(fēng)10分鐘。隨后用酒精棉球仔細(xì)擦拭臺(tái)面，并點(diǎn)燃酒精燈，創(chuàng)造無(wú)菌操作環(huán)境。
2、試劑與材料檢查
試劑盒組分：
Calcein-AM（干粉或溶液）
PI溶液
PBS緩沖液（注意： 需提前解凍）
實(shí)驗(yàn)耗材：
黑色/透明96孔板
移液槍?zhuān)?0μL與1000μL規(guī)格）
微量離心管（1.5mL）
二、實(shí)驗(yàn)步驟詳解
1、細(xì)胞處理
當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到90%時(shí)，接種于多孔板（如96孔板）。待細(xì)胞貼壁24小時(shí)后進(jìn)行加藥處理，再加藥培養(yǎng)24小時(shí)。
關(guān)鍵細(xì)節(jié)：
觀(guān)察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)，吸棄舊培養(yǎng)基
使用預(yù)溫的PBS輕柔清洗1-2次（避免細(xì)胞脫落）
96孔板每孔接種3k-5k細(xì)胞（過(guò)密會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞卷邊和假陽(yáng)性）
鋪板時(shí)采用“米”字法搖勻，確保細(xì)胞分布均勻——這直接關(guān)系到后續(xù)拍攝效果
2、染色工作液配制
嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明配制染色工作液，注意避光，且現(xiàn)用現(xiàn)配！
以碧云天試劑盒為例：
Calcein-AM : PI : 緩沖液 = 1:1:1000
即分別加入1.5μL AM、1.5μL PI和1.5mL緩沖液
3、染色孵育
根據(jù)不同孔板加入相應(yīng)體積的染色劑：
6孔板：1mL
12孔板：500μL
24孔板：250μL
96孔板：100μL
加入染色劑后，37℃避光孵育15-30分鐘。
4、洗滌與檢測(cè)
洗滌步驟：
吸棄染色液
用PBS清洗一次（減少背景干擾）
技巧：PBS沿孔壁加入，輕晃孔板，靜置1-2分鐘后吸棄
觀(guān)察檢測(cè)：
熒光顯微鏡下觀(guān)察
活細(xì)胞顯綠色（激發(fā)/發(fā)射波長(zhǎng)：494/517 nm）
死細(xì)胞顯紅色（激發(fā)/發(fā)射波長(zhǎng)：535/617 nm）
注意：避免長(zhǎng)時(shí)間曝光，防止熒光淬滅
染色效果的好壞往往取決于細(xì)節(jié)處理。PBS清洗時(shí)動(dòng)作要輕柔，避免細(xì)胞脫落；觀(guān)察時(shí)盡快完成，防止熒光淬滅影響結(jié)果判斷。
掌握這些關(guān)鍵步驟，你就能獲得清晰的活死細(xì)胞染色結(jié)果，為實(shí)驗(yàn)提供可靠的數(shù)據(jù)支持！
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