游離生物素測定培養(yǎng)基的制備方法及具體配制操作步驟！
小楊 / 2025-11-20 09:15:44
游離生物素測定培養(yǎng)基的制備需嚴(yán)格遵循“去除內(nèi)源性生物素”“保證營養(yǎng)全面性”“無菌化處理”三大核心原則，以確保生物素成為唯一的生長限制因子，準(zhǔn)確反映樣品中游離生物素的含量。以下是詳細(xì)的制備方法，以
植物乳桿菌用培養(yǎng)基（最常用類型）為例：
一、制備前的準(zhǔn)備
1、原料選擇與預(yù)處理
核心要求：所有原料需盡可能去除天然含有的生物素（如酪蛋白、酵母提取物等天然原料常含生物素）。
預(yù)處理方法（針對含生物素的原料，如酪蛋白水解物）：
活性炭吸附法：將原料溶液（濃度 10-20%）與 1-2%（w/v）活性炭混合，室溫攪拌 1-2 小時，用定性濾紙或布氏漏斗過濾 2-3 次，去除活性炭（吸附生物素）。
驗(yàn)證：預(yù)處理后的原料需通過“空白培養(yǎng)”驗(yàn)證（接種指示菌后無生長），確保生物素殘留＜0.001 ng/mL。
2、儀器與試劑準(zhǔn)備
儀器：電子天平、燒杯、容量瓶、pH 計(jì)、高壓蒸汽滅菌鍋、過濾除菌裝置、無菌試管/培養(yǎng)皿。
試劑：葡萄糖、預(yù)處理后的酪蛋白水解物、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、硫酸鎂、氯化鈉、氯化鈣、硫酸錳、硫酸亞鐵、維生素混合液（不含生物素）等。
二、具體配方與配制步驟（每升培養(yǎng)基）
（一）基礎(chǔ)配方成分
成分 用量 作用
葡萄糖 20 g 碳源，提供能量
去生物素酪蛋白水解物 10 g 氮源，提供氨基酸
磷酸二氫鉀 1 g 維持 pH 緩沖體系（目標(biāo) pH 6.8-7.0）
磷酸氫二鉀 1 g 同上
硫酸鎂（MgSO??7H?O） 0.2 g 提供鎂離子，參與酶活性調(diào)節(jié)
氯化鈉 0.1 g 提供鈉離子
氯化鈣（CaCl??2H?O） 0.02 g 提供鈣離子
硫酸錳（MnSO??4H?O） 0.01 g 提供錳離子，促進(jìn)代謝
硫酸亞鐵（FeSO??7H?O） 0.01 g 提供鐵離子，參與 redox 反應(yīng)
維生素混合液 10 mL 補(bǔ)充除生物素外的必需維生素
（二）配制步驟
1、溶解基礎(chǔ)成分
取 800 mL 蒸餾水于燒杯中，依次加入葡萄糖、去生物素酪蛋白水解物、磷酸鹽（磷酸二氫鉀 + 磷酸氫二鉀）、無機(jī)鹽（硫酸鎂、氯化鈉、氯化鈣、硫酸錳、硫酸亞鐵），攪拌至完全溶解。
2、調(diào)節(jié) pH
用 1 mol/L HCl 或 NaOH 調(diào)節(jié)溶液 pH 至 6.8-7.0（
植物乳桿菌最適 pH），用 pH 計(jì)精準(zhǔn)測定。
3、定容與分裝
將溶液轉(zhuǎn)移至 1000 mL 容量瓶中，加蒸餾水定容至 1000 mL，混合均勻。
分裝至錐形瓶或試管中（如每瓶 100 mL），注意預(yù)留滅菌膨脹空間（約 1/5 體積）。
4、高壓滅菌
121℃高壓蒸汽滅菌 15 分鐘（避免過度滅菌導(dǎo)致營養(yǎng)成分破壞，尤其是維生素前體）。
滅菌后立即取出，冷卻至 45-50℃（避免溫度過高破壞后續(xù)添加的熱敏成分）。
5、添加無菌維生素混合液
維生素混合液需單獨(dú)過濾除菌（用 0.22 μm 濾膜），待培養(yǎng)基冷卻后，按比例（每升培養(yǎng)基加 10 mL）無菌操作加入，輕輕搖勻。
6、分裝至無菌容器
若用于試管培養(yǎng)，可分裝至滅菌試管（每管 5-10 mL）；若用于平板培養(yǎng)，可趁熱倒入無菌培養(yǎng)皿（每皿 15-20 mL），冷卻凝固后備用。
三、關(guān)鍵注意事項(xiàng)
1、生物素去除效果驗(yàn)證
制備完成后，需做“空白對照實(shí)驗(yàn)”：取少量培養(yǎng)基，接種指示菌（如
植物乳桿菌），在適宜條件下培養(yǎng)。若空白組無明顯生長（濁度＜0.05），說明生物素去除合格；若有生長，需重新處理原料。
2、滅菌條件控制
滅菌時間過長或溫度過高會破壞葡萄糖、維生素等成分，導(dǎo)致培養(yǎng)基營養(yǎng)缺陷，影響微生物生長。建議嚴(yán)格遵循 121℃、15 分鐘的參數(shù)。
3、無菌操作要求
維生素混合液過濾除菌時需保證濾膜和裝置無菌；添加時需在超凈工作臺中操作，避免雜菌污染（雜菌可能不依賴生物素生長，干擾測定）。
4、儲存條件
制備好的培養(yǎng)基需在 4℃冰箱避光保存，有效期不超過 1 周（維生素易降解），使用前需恢復(fù)至室溫，避免溫度驟變影響微生物活性。
通過以上步驟制備的培養(yǎng)基，可滿足游離生物素測定的核心需求 —— 僅通過樣品中游離生物素的含量調(diào)控指示菌生長，從而實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)定量。不同指示菌（如
啤酒酵母）的培養(yǎng)基制備步驟類似，僅配方中營養(yǎng)成分需根據(jù)其需求調(diào)整。
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