乳酸桿菌選擇性培養(yǎng)基的配制方法與常見(jiàn)問(wèn)題及解決方案！
小楊 / 2025-11-27 09:51:31
乳酸桿菌（Lactobacillus）是一類革蘭氏陽(yáng)性、兼性厭氧、產(chǎn)乳酸的桿菌，廣泛存在于人和動(dòng)物腸道、發(fā)酵食品中，其選擇性培養(yǎng)基的設(shè)計(jì)核心是“抑制雜菌生長(zhǎng) + 促進(jìn)乳酸桿菌增殖 + 特異性鑒別”，通過(guò)成分優(yōu)化實(shí)現(xiàn)目標(biāo)菌株的分離純化。以下從設(shè)計(jì)原理、典型培養(yǎng)基配方解析、實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象及關(guān)鍵注意事項(xiàng)展開(kāi)詳細(xì)說(shuō)明：
一、乳酸桿菌選擇性培養(yǎng)基的核心設(shè)計(jì)原理
乳酸桿菌的生理特性是培養(yǎng)基設(shè)計(jì)的核心依據(jù)，同時(shí)針對(duì)樣品中可能存在的雜菌（如
大腸菌群、
葡萄球菌、
真菌等）設(shè)置抑制機(jī)制，具體原理包括 3 點(diǎn)：
1、營(yíng)養(yǎng)需求適配：滿足乳酸桿菌生長(zhǎng)
乳酸桿菌為chemoorganotrophic 異養(yǎng)菌，需復(fù)雜營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)：
碳源：偏好 發(fā)酵型糖類（如葡萄糖、乳糖、麥芽糖），部分菌株可利用甘露醇、果糖；
氮源：需氨基酸、肽類（依賴蛋白胨、酵母提取物、牛肉膏提供）；
生長(zhǎng)因子：必需維生素 B 族（酵母提取物富含）、脂肪酸、核酸衍生物；
厭氧/微需氧環(huán)境：多數(shù)乳酸桿菌無(wú)過(guò)氧化氫酶，需避免氧氣積累（培養(yǎng)基可添加還原劑，或培養(yǎng)時(shí)用厭氧罐）。
2、選擇性抑制雜菌：關(guān)鍵成分的作用
樣品中雜菌種類多，需通過(guò)以下成分抑制：
抑制成分 作用機(jī)制 抑制對(duì)象
乙酸/乳酸 降低培養(yǎng)基 pH（至 5.0-5.5），乳酸桿菌耐酸（最適 pH 5.5-6.5），雜菌（如
大腸菌群、
芽孢桿菌）耐酸性差 革蘭氏陰性菌、多數(shù)需氧菌
疊氮鈉（0.02%-0.05%） 抑制細(xì)胞色素氧化酶，阻斷呼吸鏈，乳酸桿菌可耐受低濃度疊氮鈉 革蘭氏陰性菌、部分革蘭氏陽(yáng)性菌（如
葡萄球菌）
萬(wàn)古霉素（5-10 μg/mL） 抑制革蘭氏陽(yáng)性菌細(xì)胞壁肽聚糖合成，乳酸桿菌對(duì)萬(wàn)古霉素天然耐受（肽聚糖結(jié)構(gòu)特殊） 雜革蘭氏陽(yáng)性菌（如
鏈球菌、
芽孢桿菌）
山梨酸鉀/丙酸 抑制真菌細(xì)胞膜合成，乳酸桿菌對(duì)其耐受 霉菌、酵母菌
3、鑒別功能：區(qū)分乳酸桿菌與其他耐酸菌
部分培養(yǎng)基添加指示劑，通過(guò)乳酸發(fā)酵特性鑒別：
酸堿指示劑：乳酸桿菌發(fā)酵糖類產(chǎn)乳酸，使培養(yǎng)基 pH 降低，指示劑變色（溴甲酚綠由藍(lán)綠色變?yōu)辄S色，酚紅由紅色變?yōu)辄S色）；
碳酸鈣（CaCO?）：作為緩沖劑維持 pH，同時(shí)乳酸發(fā)酵產(chǎn)生的乳酸可溶解 CaCO?，形成透明圈，直觀區(qū)分產(chǎn)乳酸菌株與非產(chǎn)乳酸菌株。
二、典型乳酸桿菌選擇性培養(yǎng)基配方及解析
常用培養(yǎng)基包括 MRS 培養(yǎng)基、RSMA 培養(yǎng)基、LBS 培養(yǎng)基，其中 MRS 培養(yǎng)基應(yīng)用最廣泛，具體配方（1L）及關(guān)鍵成分作用如下：
成分 含量 核心作用
蛋白胨 10 g 提供氨基酸、肽類（氮源）
牛肉膏 10 g 提供維生素、礦物質(zhì)（生長(zhǎng)因子）
酵母提取物 5 g 提供 B 族維生素、核酸衍生物（必需生長(zhǎng)因子）
葡萄糖 20 g 主要碳源，發(fā)酵產(chǎn)乳酸
乙酸鈉 5 g 調(diào)節(jié) pH，抑制雜菌，促進(jìn)乳酸桿菌增殖
檸檬酸二銨 2 g 螯合金屬離子，抑制部分雜菌（如
芽孢桿菌）
硫酸鎂（MgSO??7H?O） 0.58 g 微量元素（鎂離子參與酶活性）
硫酸錳（MnSO??4H?O） 0.25 g 微量元素（錳離子促進(jìn)乳酸發(fā)酵）
吐溫 80 1 mL 表面活性劑，促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)吸收，保護(hù)乳酸桿菌免受氧氣損傷
碳酸鈣（CaCO?） 15-20 g 緩沖 pH，鑒別產(chǎn)乳酸菌株（形成溶鈣圈）
瓊脂 15-20 g 凝固劑（液體培養(yǎng)基不加）
蒸餾水 1000 mL 溶劑
pH 調(diào)節(jié) 6.2-6.4（滅菌前） 適配乳酸桿菌最適生長(zhǎng) pH
選擇性改良：若樣品中雜菌較多，可添加萬(wàn)古霉素（5 μg/mL）或疊氮鈉（0.02%），進(jìn)一步抑制雜菌；若需抑制真菌，可添加氯霉素（10 μg/mL）或山梨酸鉀（0.1%）。
三、實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象及結(jié)果判讀
1、培養(yǎng)條件
溫度：35-37℃（多數(shù)乳酸桿菌最適生長(zhǎng)溫度）；
環(huán)境：厭氧或微需氧（用厭氧罐 + 厭氧包，或 CO?培養(yǎng)箱，CO?濃度 5%-10%）；
培養(yǎng)時(shí)間：48-72 h（乳酸桿菌生長(zhǎng)較慢，需延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間至菌落形成）。
2、典型實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象（以培養(yǎng)基為例）
觀察指標(biāo) 乳酸桿菌特征 雜菌特征
菌落形態(tài) 圓形、凸起、邊緣整齊，直徑 1-2 mm，表面光滑、乳白色或淡黃色，質(zhì)地黏稠 革蘭氏陰性菌：菌落較大、透明或半透明，無(wú)溶鈣圈；真菌：菌落絨毛狀、顏色多樣，無(wú)溶鈣圈；雜革蘭氏陽(yáng)性菌：多數(shù)被抑制，若生長(zhǎng)則無(wú)溶鈣圈或溶鈣圈不明顯
溶鈣圈 菌落周圍出現(xiàn)清晰的透明圈（CaCO?被乳酸溶解），溶鈣圈直徑通常大于菌落直徑（產(chǎn)乳酸能力越強(qiáng)，溶鈣圈越大） 無(wú)溶鈣圈（不產(chǎn)乳酸或產(chǎn)乳酸量極少）
革蘭氏染色 革蘭氏陽(yáng)性，桿菌（長(zhǎng)桿、短桿或鏈狀排列），無(wú)芽孢，無(wú)鞭毛（多數(shù)菌株） 革蘭氏陰性菌：紅色，桿狀或球狀；雜革蘭氏陽(yáng)性菌：紫色，但無(wú)溶鈣圈，形態(tài)可能為球菌或芽孢桿菌
生化反應(yīng)（輔助鑒別） 發(fā)酵葡萄糖、乳糖產(chǎn)酸不產(chǎn)氣，過(guò)氧化氫酶陰性，硝酸鹽還原陰性 發(fā)酵葡萄糖可能產(chǎn)氣，過(guò)氧化氫酶陽(yáng)性（多數(shù)雜菌）
3、其他培養(yǎng)基的實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象
MRS 培養(yǎng)基（無(wú) CaCO?）：添加溴甲酚綠指示劑，培養(yǎng)基初始為藍(lán)綠色，乳酸桿菌生長(zhǎng)后周圍變?yōu)辄S色（產(chǎn)酸導(dǎo)致 pH 降低）；
LBS 培養(yǎng)基：針對(duì)雙歧桿菌和乳酸桿菌設(shè)計(jì)，乳酸桿菌菌落為乳白色、凸起，雙歧桿菌菌落為淡粉色、邊緣不規(guī)則，兩者均有溶鈣圈；
RSMA 培養(yǎng)基：含高濃度乙酸（0.5%），抑制雜菌能力更強(qiáng)，乳酸桿菌菌落較小、乳白色，溶鈣圈清晰。
四、關(guān)鍵注意事項(xiàng)（影響實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象準(zhǔn)確性）
培養(yǎng)基 pH 控制：滅菌前 pH 需嚴(yán)格調(diào)至 6.2-6.4，pH 過(guò)高會(huì)降低選擇性（雜菌易生長(zhǎng)），pH 過(guò)低會(huì)抑制乳酸桿菌生長(zhǎng)；
厭氧環(huán)境控制：乳酸桿菌為兼性厭氧，厭氧環(huán)境可促進(jìn)生長(zhǎng)，避免氧氣積累導(dǎo)致菌落生長(zhǎng)緩慢或不生長(zhǎng)（若用有氧培養(yǎng)，部分菌株可能僅形成微小菌落，溶鈣圈不明顯）；
抑制成分濃度：疊氮鈉、萬(wàn)古霉素等抑制成分濃度需準(zhǔn)確，濃度過(guò)高會(huì)抑制乳酸桿菌，過(guò)低則無(wú)法有效抑制雜菌；
樣品處理：含雜菌多的樣品需進(jìn)行梯度稀釋（10?³-10??），避免雜菌過(guò)度生長(zhǎng)掩蓋乳酸桿菌菌落；
培養(yǎng)時(shí)間：至少培養(yǎng) 48 h，部分慢生長(zhǎng)菌株需培養(yǎng) 72 h，否則溶鈣圈不明顯，易誤判；
排除污染：培養(yǎng)基滅菌不徹底會(huì)導(dǎo)致雜菌污染，需確保 121℃高壓滅菌 15-20 min；
生化驗(yàn)證：僅通過(guò)菌落形態(tài)和溶鈣圈不足以完全鑒定乳酸桿菌，需結(jié)合革蘭氏染色、過(guò)氧化氫酶試驗(yàn)、糖發(fā)酵試驗(yàn)等生化指標(biāo)，或 16S rRNA 基因測(cè)序確認(rèn)。
五、常見(jiàn)問(wèn)題及解決方案（實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象異常）
異?，F(xiàn)象 可能原因 解決方案
無(wú)乳酸桿菌菌落生長(zhǎng) 1.培養(yǎng)基 pH 過(guò)低或抑制成分濃度過(guò)高；2.厭氧環(huán)境未達(dá)標(biāo)；3.樣品中乳酸桿菌含量極低；4.培養(yǎng)時(shí)間不足 1.調(diào)整 pH 至 6.2-6.4，降低抑制成分濃度；2.檢查厭氧包有效性；3.增加樣品接種量或延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間至 72 h；4.樣品預(yù)處理時(shí)避免高溫
雜菌大量生長(zhǎng)，掩蓋乳酸桿菌 1.抑制成分添加不足；2.培養(yǎng)基 pH 過(guò)高；3.樣品稀釋倍數(shù)不夠 1.按比例添加疊氮鈉或萬(wàn)古霉素；2.重新調(diào)整培養(yǎng)基 pH；3.增加稀釋倍數(shù)，減少雜菌接種量
菌落無(wú)溶鈣圈 1.菌株不產(chǎn)乳酸（非乳酸桿菌）；2.培養(yǎng)時(shí)間不足；3.CaCO?添加量不足或未均勻分散 1.結(jié)合生化試驗(yàn)排除非目標(biāo)菌株；2.延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間至 72 h；3.確保 CaCO?均勻分散，添加量不低于 15 g/L
溶鈣圈不清晰 1. 產(chǎn)乳酸量少；2.培養(yǎng)基 pH 過(guò)高（緩沖能力強(qiáng)，pH 下降不明顯）；3.瓊脂濃度過(guò)高（乳酸擴(kuò)散受阻） 1.改用 MRS 液體培養(yǎng)基培養(yǎng)，通過(guò) pH 計(jì)檢測(cè)產(chǎn)酸情況；2.降低培養(yǎng)基 pH 至 6.0；3.瓊脂濃度調(diào)至 15 g/L（避免過(guò)高）
總結(jié)
乳酸桿菌選擇性培養(yǎng)基的核心是“耐酸特性 + 營(yíng)養(yǎng)適配 + 雜菌抑制 + 產(chǎn)乳酸鑒別”，培養(yǎng)基是最常用的選擇，其典型實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象為乳白色黏稠菌落 + 周圍透明溶鈣圈 + 革蘭氏陽(yáng)性桿菌。通過(guò)嚴(yán)格控制培養(yǎng)基配方、培養(yǎng)條件及樣品處理流程，可實(shí)現(xiàn)乳酸桿菌的高效分離與初步鑒別，為后續(xù)的菌種鑒定、計(jì)數(shù)或功能研究奠定基礎(chǔ)。若需進(jìn)一步精準(zhǔn)鑒定，需結(jié)合生化試驗(yàn)或分子生物學(xué)方法。
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