啟動厭氧工作站（核心設(shè)備），設(shè)定參數(shù)：溫度 35-37℃，氣體比例 85% N?+10% H?+5% CO?，厭氧指示劑（亞甲藍）呈無色（確認無氧）。
接種環(huán)、試管、培養(yǎng)皿等經(jīng)高壓蒸汽滅菌（121℃，15min），干燥后移入?yún)捬豕ぷ髡尽?/div>
注射器（20ml，帶橡膠塞）、厭氧轉(zhuǎn)運管（含 0.5ml 還原劑如 0.05% 半胱氨酸）提前滅菌備用。
2、培養(yǎng)基準備
基礎(chǔ)培養(yǎng)基：選擇適合厭氧菌生長的非選擇性培養(yǎng)基（如布氏血瓊脂、哥倫比亞血瓊脂）和選擇性培養(yǎng)基（如擬桿菌瓊脂、梭菌鑒別瓊脂），添加生長因子（維生素 K? 10μg/ml + 血紅素 5μg/ml）。
預(yù)還原處理：培養(yǎng)基在厭氧工作站內(nèi)放置 24-48 小時，或 37℃孵育 2 小時，確保氧化還原電位（Eh）< -300mV（表面無氧化層，顏色均勻）。
二、標本采集與轉(zhuǎn)運
1、標本采集原則
避免污染：從無菌部位采集，或用外科方法避開正常菌群。
減少氧暴露：
液體標本：用滅菌注射器抽取，立即排出空氣（保留標本量占注射器容積 2/3），針頭插入橡膠塞密封，標注“厭氧”。
固體標本（組織、膿液）：用滅菌鑷子放入預(yù)還原的厭氧轉(zhuǎn)運管，擰緊蓋子（確保無氣泡）。
2、禁忌采集標本
唾液、痰液（混口腔菌群）、肛拭子（腸道正常菌群干擾）等除非特殊指征，否則不用于厭氧培養(yǎng)。
3、標本轉(zhuǎn)運
條件：1 小時內(nèi)送達實驗室，無法及時轉(zhuǎn)運時，室溫（20-25℃）保存（禁止冷藏，避免抑制厭氧菌活性）。
記錄：標注采集時間、部位、患者信息，附臨床診斷。
三、實驗室處理（核心步驟）
1、標本接收與核對
檢查轉(zhuǎn)運裝置是否密封、有無破損，厭氧指示劑是否變色（若轉(zhuǎn)運管內(nèi)指示劑氧化，標本可能失效）。
登記信息，立即移入?yún)捬豕ぷ髡咎幚恚◤慕邮罩吝M入無氧環(huán)境不超過 10 分鐘）。
2、標本預(yù)處理
液體標本：
血液：用無菌注射器抽取 5-10ml，注入?yún)捬跹囵B(yǎng)瓶（含還原劑），輕輕混勻。
胸腹水/膿液：4000rpm 離心 10 分鐘，取沉淀用于接種（提高菌濃度）。
固體標本：
組織塊：在厭氧工作站內(nèi)用滅菌剪刀剪碎，加入 1ml 預(yù)還原生理鹽水研磨成勻漿。
膿腫標本：直接用接種環(huán)挑取膿性部分（優(yōu)先選深部或帶血絲的膿汁）。
3、接種操作（全程在厭氧工作站內(nèi)進行）
接種方式：
劃線接種：將標本在非選擇性培養(yǎng)基和選擇性培養(yǎng)基上連續(xù)劃線（三區(qū)劃線法），保證單菌落生長。
定量接種：若需計數(shù)，取 100μl 標本勻漿，做 10 倍系列稀釋，各稀釋度取 10μl 涂布平板。
注意事項：
接種環(huán)灼燒后，需在培養(yǎng)基邊緣冷卻 10 秒，避免燙死細菌。
每接種 1 份標本，更換 1 個接種環(huán)，防止交叉污染。
4、培養(yǎng)條件設(shè)置
培養(yǎng)裝置：接種后的平板放入?yún)捬豕ぷ髡荆ɑ騾捬豕?，加入產(chǎn)氣包和催化劑，密封后 37℃孵育）。
培養(yǎng)時間：
常規(guī)厭氧菌（如
脆弱類桿菌）：48-72 小時觀察菌落。
慢生長厭氧菌（如
放線菌）：延長至 7-14 天，期間每周補充 1 次培養(yǎng)基水分（避免干燥）。
四、菌落觀察與鑒定
1、菌落形態(tài)觀察
每日在厭氧工作站內(nèi)觀察菌落（避免移出暴露氧氣），記錄形態(tài)（大小、形狀、顏色、溶血環(huán)）。
典型特征：如梭菌菌落邊緣不整齊、有溶血；擬桿菌菌落呈圓形、灰白色。
2、純度驗證與傳代
挑取可疑菌落，涂片革蘭染色（在工作站內(nèi)操作，染色液需預(yù)還原），鏡檢確認形態(tài)一致（如革蘭陰性桿菌、革蘭陽性芽胞桿菌）。
純培養(yǎng)：將單菌落轉(zhuǎn)接至新鮮預(yù)還原培養(yǎng)基，37℃厭氧培養(yǎng) 24 小時，用于后續(xù)鑒定。
3、鑒定方法
生化試驗：使用厭氧菌生化鑒定管，37℃厭氧孵育 48 小時判讀結(jié)果。
分子生物學(xué)：提取 DNA，通過 16S rRNA 基因測序鑒定（需在無氧條件下提取，避免 DNA 降解）。
五、質(zhì)量控制與安全
1、質(zhì)量控制
陰性對照：用無菌生理鹽水替代標本，接種后無菌落生長，排除污染。
2、安全防護
操作致病性厭氧菌（如
破傷風梭菌）時，穿生物安全服、戴手套，避免銳器劃傷。
廢棄標本和污染耗材：高壓蒸汽滅菌（121℃，30min）后按醫(yī)療廢物處理。
六、結(jié)果記錄與報告
記錄內(nèi)容：標本信息、培養(yǎng)基類型、培養(yǎng)時間、菌落特征、染色結(jié)果、鑒定結(jié)論。
報告格式：明確厭氧菌種類（如“
脆弱類桿菌”）、菌落計數(shù)（若定量）、藥敏結(jié)果（如需要）。
關(guān)鍵原則：全程最大限度減少標本與氧氣接觸，所有操作優(yōu)先在厭氧工作站內(nèi)完成，確保厭氧菌從采集到鑒定的“無氧鏈”不中斷，是提高分離成功率的核心。
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