阪崎腸桿菌顯色培養(yǎng)基的使用方法及常見(jiàn)問(wèn)題與解決方案！
小楊 / 2025-12-05 09:58:40
阪崎腸桿菌顯色培養(yǎng)基的使用需嚴(yán)格遵循“培養(yǎng)基制備 - 樣品處理 - 接種培養(yǎng) - 結(jié)果觀察”的流程，同時(shí)關(guān)注操作細(xì)節(jié)以避免假陽(yáng)性/假陰性，以下是標(biāo)準(zhǔn)化使用方法及關(guān)鍵注意事項(xiàng)，結(jié)合國(guó)標(biāo)（GB 4789.40-2016）和行業(yè)實(shí)踐整理：
一、完整使用方法（含前處理與后續(xù)驗(yàn)證）
1、培養(yǎng)基制備（核心：溶解、滅菌、傾注）
步驟 操作細(xì)節(jié) 關(guān)鍵參數(shù)
稱(chēng)量 按產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)稱(chēng)取干粉培養(yǎng)基，加入相應(yīng)體積的蒸餾水或去離子水 稱(chēng)量需準(zhǔn)確，避免因濃度偏差影響選擇性和顯色效果
溶解 加熱煮沸并持續(xù)攪拌，直至培養(yǎng)基完全溶解（無(wú)顆粒、無(wú)渾濁） 不可過(guò)度煮沸（避免顯色底物分解），溶解后需澄清透明
滅菌 121℃高壓蒸汽滅菌 15min（立式滅菌鍋：壓力 0.1MPa） 滅菌時(shí)間不足易污染，過(guò)長(zhǎng)會(huì)破壞營(yíng)養(yǎng)成分和顯色底物；若滅菌后出現(xiàn)沉淀，需棄用
冷卻 滅菌后取出，在無(wú)菌環(huán)境中冷卻至 45-50℃（手感不燙手） 溫度過(guò)高會(huì)殺死后續(xù)接種的目標(biāo)菌，過(guò)低易導(dǎo)致培養(yǎng)基凝固無(wú)法傾注
傾注 每個(gè)無(wú)菌平皿（直徑 90mm）傾注約 20mL 培養(yǎng)基，水平放置待凝固（約 15-20min） 傾注時(shí)避免氣泡產(chǎn)生；凝固后若表面有水珠，需倒置在 36℃培養(yǎng)箱中烘干 10-15min
2、樣品前處理（必做：增菌培養(yǎng)，消除雜菌干擾）
阪崎腸桿菌在食品中污染量低，需先通過(guò)增菌富集，再接種顯色培養(yǎng)基：
按國(guó)標(biāo) GB 4789.40-2016 流程：
取 25g（或 25mL）樣品，加入 225mL mLST-Vm 增菌液（含萬(wàn)古霉素），36℃±1℃培養(yǎng) 18-24h（一級(jí)增菌）；
取 1mL 一級(jí)增菌液，轉(zhuǎn)入 10mL EE 增菌液（腸桿菌科增菌液），44℃±0.5℃培養(yǎng) 22-26h（二級(jí)增菌，選擇性富集阪崎腸桿菌）；
若為環(huán)境樣品（如設(shè)備表面棉拭子）：將棉拭子放入 10mL mLST-Vm 增菌液，按上述條件增菌后接種。
3、接種與培養(yǎng)
接種方式：用無(wú)菌接種環(huán)取 0.1mL 二級(jí)增菌液，在顯色培養(yǎng)基平板上進(jìn)行劃線分離（三區(qū)劃線法，確保單菌落生長(zhǎng)）；或采用涂布法（0.1mL 樣品 + 無(wú)菌玻璃涂棒均勻涂布）；
培養(yǎng)條件：倒置放入 36℃±1℃恒溫培養(yǎng)箱，培養(yǎng) 22-26h（不可超過(guò) 28h，否則雜菌過(guò)度生長(zhǎng)會(huì)掩蓋目標(biāo)菌落）。
4、結(jié)果觀察與后續(xù)確認(rèn)
典型菌落特征：在淡黃色/乳白色培養(yǎng)基背景上，
阪崎腸桿菌形成藍(lán)綠色、圓形、光滑、邊緣整齊的菌落（直徑 1-2mm），部分菌株可能呈現(xiàn)淺綠色（因菌株差異）；
非目標(biāo)菌表現(xiàn)：
大腸埃希氏菌為無(wú)色/淡黃色菌落，
變形桿菌可能為灰黑色菌落（含硫化氫產(chǎn)生），革蘭氏陽(yáng)性菌被膽鹽抑制（無(wú)明顯菌落或微小菌落）；
確認(rèn)步驟：挑取 3-5 個(gè)典型藍(lán)綠色菌落，分別接種 TSI 斜面（三糖鐵瓊脂）和賴氨酸脫羧酶培養(yǎng)基，或使用生化鑒定試劑盒，同時(shí)進(jìn)行血清學(xué)鑒定或 PCR 驗(yàn)證（國(guó)標(biāo)要求最終生化鑒定確認(rèn)，避免顯色假陽(yáng)性）。
二、關(guān)鍵注意事項(xiàng)（按操作環(huán)節(jié)分類(lèi)，規(guī)避常見(jiàn)問(wèn)題）
1、培養(yǎng)基制備階段
底物穩(wěn)定性：顯色底物對(duì)熱敏感，滅菌時(shí)需嚴(yán)格控制溫度和時(shí)間（121℃/15min），不可二次滅菌；若培養(yǎng)基儲(chǔ)存后出現(xiàn)顏色變深（如變?yōu)樯铧S色），需棄用；
儲(chǔ)存條件：干粉培養(yǎng)基需密封置于 2-8℃冷藏，避免潮濕和光照；配好的滅菌培養(yǎng)基（未傾注）可在 4℃冷藏保存 1 周，傾注后的平板需密封倒置保存，1 周內(nèi)使用；
pH 控制：培養(yǎng)基最終 pH 為 7.3±0.2，若滅菌后 pH 偏差過(guò)大，會(huì)影響細(xì)菌生長(zhǎng)和顯色，需在溶解時(shí)用 NaOH 或 HCl 微調(diào)。
2、樣品處理與接種階段
增菌液選擇：必須使用含選擇性抑制劑的增菌液（mLST-Vm+EE），若省略二級(jí)增菌或使用普通增菌液，雜菌（如大腸菌群）會(huì)大量繁殖，導(dǎo)致顯色平板上目標(biāo)菌落被掩蓋；
接種量控制：劃線法接種量不超過(guò) 0.1mL，涂布法需確保樣品均勻分布，避免菌液過(guò)多導(dǎo)致菌落重疊；
無(wú)菌操作：全程在超凈工作臺(tái)或無(wú)菌室進(jìn)行，避免環(huán)境雜菌污染（尤其是藍(lán)綠色雜菌，可能導(dǎo)致假陽(yáng)性）；接種工具需滅菌徹底（接種環(huán)灼燒滅菌后冷卻使用，避免燙傷細(xì)菌）。
3、培養(yǎng)與結(jié)果觀察階段
培養(yǎng)溫度：嚴(yán)格控制在 36℃±1℃，溫度過(guò)高（如 37℃以上）可能導(dǎo)致顯色提前或菌落過(guò)大，溫度過(guò)低（如 35℃以下）會(huì)延長(zhǎng)顯色時(shí)間，甚至不顯色；
觀察時(shí)機(jī)：必須在 22-26h 內(nèi)觀察結(jié)果，超過(guò) 26h 后，部分雜菌（如
克雷伯氏菌）可能產(chǎn)生微弱藍(lán)綠色，導(dǎo)致假陽(yáng)性；
菌落挑?。喝羝桨迳蠠o(wú)典型藍(lán)綠色菌落，需延長(zhǎng)培養(yǎng)至 48h（仍無(wú)則判定為陰性）；若有疑似菌落（淺綠色、邊緣不整齊），需同時(shí)挑取進(jìn)行生化鑒定，避免漏檢。
4、質(zhì)量控制與方法驗(yàn)證
每次實(shí)驗(yàn)需設(shè)置質(zhì)控平板：
陽(yáng)性對(duì)照：接種阪崎腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株（
ATCC 29544），應(yīng)形成典型藍(lán)綠色菌落；
空白對(duì)照：未接種的顯色培養(yǎng)基平板，培養(yǎng)后無(wú)任何菌落生長(zhǎng)；
方法驗(yàn)證：若用于第三方檢測(cè)或監(jiān)管抽檢，需按國(guó)標(biāo)要求進(jìn)行方法驗(yàn)證（如檢出限、特異性、重復(fù)性），確保符合 GB 4789.40-2016 或 ISO 22964:2017 標(biāo)準(zhǔn)。
5、安全與廢棄物處理
阪崎腸桿菌為致病菌，實(shí)驗(yàn)操作需在生物安全二級(jí)（BSL-2）實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行，操作人員需穿戴防護(hù)服、手套、口罩，避免氣溶膠污染；
實(shí)驗(yàn)廢棄物（含培養(yǎng)基、菌液、接種工具）需經(jīng)高壓滅菌（121℃/30min）或化學(xué)消毒后，再按醫(yī)療廢棄物處理，避免環(huán)境傳播。
三、常見(jiàn)問(wèn)題與解決方案
常見(jiàn)問(wèn)題 可能原因 解決方案
無(wú)藍(lán)綠色菌落（疑似漏檢） 1.增菌條件不當(dāng)（溫度/時(shí)間偏差）；2.培養(yǎng)基顯色底物失效；3.樣品中無(wú)阪崎腸桿菌 1. 嚴(yán)格按 36℃/18-24h（一級(jí)增菌）、44℃/22-26h（二級(jí)增菌）操作；2.更換新批次培養(yǎng)基，做陽(yáng)性對(duì)照驗(yàn)證；3.按國(guó)標(biāo)流程重復(fù)檢測(cè)
藍(lán)綠色菌落過(guò)多（假陽(yáng)性） 1.雜菌污染；2.接種量過(guò)大；3.培養(yǎng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng) 1.加強(qiáng)增菌液選擇性（確保萬(wàn)古霉素濃度達(dá)標(biāo)）；2.減少接種量（≤0.1mL）；3.嚴(yán)格控制培養(yǎng)時(shí)間（22-26h）；4.對(duì)疑似菌落進(jìn)行生化鑒定確認(rèn)
培養(yǎng)基凝固后表面有水珠 1.冷卻速度過(guò)快；2.傾注后未烘干 1.滅菌后緩慢冷卻至 45-50℃再傾注；2.凝固后倒置在 36℃培養(yǎng)箱中烘干 10-15min
菌落生長(zhǎng)稀疏 1.培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)成分破壞（過(guò)度滅菌）；2.樣品前處理時(shí)菌液稀釋過(guò)度 1.嚴(yán)格控制滅菌參數(shù)，避免二次滅菌；2.檢查增菌液接種比例（1:10 稀釋?zhuān)?，確保富集效果
四、總結(jié)
阪崎腸桿菌顯色培養(yǎng)基的使用核心是“標(biāo)準(zhǔn)化流程 + 質(zhì)量控制”，需嚴(yán)格遵循增菌 - 接種 - 培養(yǎng) - 鑒定的全流程規(guī)范，重點(diǎn)關(guān)注培養(yǎng)基穩(wěn)定性、增菌選擇性、培養(yǎng)條件一致性，同時(shí)通過(guò)質(zhì)控菌株驗(yàn)證確保檢測(cè)準(zhǔn)確性。其優(yōu)勢(shì)是快速篩選（22-26h 出初步結(jié)果），但需注意“顯色僅為初步篩選，最終鑒定依賴生化/分子生物學(xué)方法”，避免直接以顯色結(jié)果作為判定依據(jù)（尤其用于監(jiān)管檢測(cè)時(shí)）。
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