培養(yǎng)基滅菌處理的常用方法與操作流程及適用場景！
小楊 / 2025-12-04 10:10:56
培養(yǎng)基的滅菌處理是微生物實驗和細胞培養(yǎng)中至關重要的環(huán)節(jié)，其核心目標是徹底殺滅培養(yǎng)基中的所有微生物（包括細菌、真菌、芽孢、病毒等），同時最大程度保留營養(yǎng)成分的活性。根據(jù)培養(yǎng)基成分特性、實驗需求等，常用的滅菌方法主要分為熱力滅菌法、過濾除菌法，此外還有輻射滅菌法、化學滅菌法等輔助方式。以下詳細介紹各類方法的原理、操作流程、適用場景及關鍵注意事項：
一、熱力滅菌法
熱力滅菌法利用高溫破壞微生物的蛋白質(zhì)、核酸等生物大分子結構，使其失去活性，是應用最廣泛的滅菌方式，根據(jù)加熱介質(zhì)不同分為高壓蒸汽滅菌法、干熱滅菌法、流通蒸汽滅菌法等。
（一）高壓蒸汽滅菌法
滅菌原理：在密閉的高壓蒸汽滅菌鍋內(nèi)，蒸汽壓力升高時，溫度隨之升高（壓力 0.1MPa 時，溫度可達 121℃），高溫蒸汽能快速滲透到培養(yǎng)基內(nèi)部，殺滅包括芽孢在內(nèi)的所有微生物。
適用范圍：普通微生物液體培養(yǎng)基、固體培養(yǎng)基（含瓊脂）、實驗器具（如三角燒瓶、試管、培養(yǎng)皿等）。
操作流程
前期準備：將配制好的培養(yǎng)基分裝到無菌容器中，瓶口塞入棉塞或硅膠塞，用牛皮紙或鋁箔紙包裹密封；將容器均勻擺放入滅菌鍋內(nèi)，確保蒸汽能自由流通，避免堆疊過密。
排氣升溫：關閉滅菌鍋門，啟動設備，先打開排氣閥排出鍋內(nèi)冷空氣（冷空氣殘留會導致局部溫度不足，滅菌不徹底），待排出的蒸汽連續(xù)且無白霧時，關閉排氣閥。
恒溫滅菌：當鍋內(nèi)壓力升至 0.1MPa、溫度達到 121℃時，開始計時，常規(guī)培養(yǎng)基滅菌 20-30 分鐘；若培養(yǎng)基體積較大（如 500mL 以上）或含大量有機物，可延長至 30-40 分鐘。
冷卻泄壓：滅菌結束后，關閉電源，待鍋內(nèi)壓力自然降至常壓、溫度降至 80℃以下時，緩慢打開排氣閥，再打開鍋門取出培養(yǎng)基，冷卻后備用。
關鍵注意事項
必須徹底排出冷空氣，否則會出現(xiàn)“假壓力”現(xiàn)象（壓力達到設定值但溫度不足），導致滅菌失敗。
培養(yǎng)基分裝量不宜過多，三角燒瓶不超過容積的 1/2，試管不超過 1/3，避免滅菌時液體沸騰溢出。
含葡萄糖等易分解成分的培養(yǎng)基，需降低滅菌參數(shù)（115℃、0.06MPa，20 分鐘），或單獨滅菌后與其他成分混合。
（二）干熱滅菌法
干熱滅菌法通過高溫干燥空氣殺滅微生物，適用于耐高溫且怕潮濕的實驗器具，較少直接用于培養(yǎng)基滅菌（僅適用于極少數(shù)耐高溫的固體成分）。
滅菌原理：在干熱環(huán)境中，微生物的蛋白質(zhì)脫水凝固、核酸降解，從而達到滅菌目的。
適用范圍：玻璃器皿（如培養(yǎng)皿、移液管）、金屬器具等；也可用于部分耐高溫的固體培養(yǎng)基成分（如瓊脂粉，需提前干燥）。
操作流程
將待滅菌物品放入干熱滅菌箱，均勻擺放，避免遮擋通風口。
設定溫度 160-170℃，加熱 2-3 小時（若溫度升至 180℃，可縮短至 1 小時）。
滅菌結束后，關閉電源，待滅菌箱自然冷卻至室溫后，取出物品，避免高溫下打開導致玻璃器皿炸裂。
關鍵注意事項
干熱滅菌時溫度不可超過 180℃，否則會導致玻璃器皿變形、棉塞碳化。
待滅菌物品需干燥，避免潮濕環(huán)境影響滅菌效果。
（三）流通蒸汽滅菌法
流通蒸汽滅菌法利用 100℃的常壓蒸汽進行滅菌，適用于含熱敏感成分且對滅菌要求不高的培養(yǎng)基。
滅菌原理：100℃的蒸汽可殺滅微生物的營養(yǎng)體，但無法殺滅芽孢，需多次滅菌才能達到徹底滅菌效果（即間歇滅菌法）。
適用范圍：含維生素、氨基酸等熱敏感成分的培養(yǎng)基，或用于短期使用的實驗用培養(yǎng)基。
操作流程
將培養(yǎng)基放入流通蒸汽滅菌器或蒸籠中，加熱至 100℃，保持 30 分鐘，殺滅營養(yǎng)體。
取出培養(yǎng)基，置于 37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 24 小時，使芽孢萌發(fā)為營養(yǎng)體。
重復上述滅菌和培養(yǎng)步驟 2-3 次，直至徹底殺滅芽孢。
關鍵注意事項：該方法滅菌周期長，僅適用于對滅菌效率要求較低的場景，且需嚴格控制培養(yǎng)步驟，確保芽孢完全萌發(fā)。
二、過濾除菌法
過濾除菌法通過濾膜的物理攔截作用去除微生物，不涉及高溫處理，適用于含熱敏感成分的培養(yǎng)基（如細胞培養(yǎng)基、含抗生素的培養(yǎng)基）。
滅菌原理：使用孔徑小于微生物的濾膜（常用 0.22μm，可攔截細菌、真菌等；若需去除病毒，可用 0.1μm 濾膜），通過壓力差使培養(yǎng)基通過濾膜，微生物被攔截在濾膜上，從而獲得無菌培養(yǎng)基。
適用范圍：含血清、抗生素、生長因子、酶類等熱敏感成分的培養(yǎng)基，如細胞培養(yǎng)基、含青霉素的篩選培養(yǎng)基。
操作流程
前期準備：將過濾裝置（如一次性無菌過濾杯、真空過濾系統(tǒng)）、接收容器（如無菌離心管、三角燒瓶）在無菌操作臺內(nèi)組裝，濾膜需提前檢查完整性（如通過氣泡點試驗）。
預滅菌處理：對可重復使用的過濾裝置，需先經(jīng)高壓蒸汽滅菌；一次性裝置拆封后直接在無菌環(huán)境下使用。
過濾操作：將待除菌的培養(yǎng)基倒入過濾裝置，開啟真空泵或加壓裝置，控制流速均勻，避免濾膜堵塞；若培養(yǎng)基黏度較大，可適當降低流速或分多次過濾。
收集儲存：過濾后的無菌培養(yǎng)基收集到無菌容器中，密封后置于 4℃冰箱短期保存，含抗生素的培養(yǎng)基建議現(xiàn)配現(xiàn)用。
關鍵注意事項
操作全程需在無菌操作臺內(nèi)進行，避免環(huán)境微生物污染。
濾膜使用后需及時處理，避免微生物擴散；若過濾過程中濾膜破損，需重新過濾。
過濾前可先將培養(yǎng)基預過濾（用 0.45μm 濾膜），去除大顆粒雜質(zhì)，延長 0.22μm 濾膜的使用壽命。
三、其他滅菌方法
（一）輻射滅菌法
滅菌原理：利用紫外線、γ 射線等輻射能量破壞微生物的核酸結構，使其死亡。
適用范圍：主要用于培養(yǎng)基的表面滅菌或包裝后的滅菌，如已分裝密封的固體培養(yǎng)基平板，可通過紫外線照射表面滅菌；大規(guī)模生產(chǎn)中也可使用 γ 射線對包裝好的培養(yǎng)基進行滅菌。
關鍵注意事項：紫外線穿透力弱，僅能殺滅表面微生物，且對營養(yǎng)成分有一定破壞作用，需控制照射時間；γ 射線滅菌需專業(yè)設備，且需注意輻射防護。
（二）化學滅菌法
滅菌原理：利用化學消毒劑殺滅微生物，但由于化學物質(zhì)會殘留于培養(yǎng)基中，影響微生物或細胞生長，因此極少直接用于培養(yǎng)基滅菌。
適用范圍：僅用于培養(yǎng)基制備環(huán)境的消毒（如無菌操作臺表面消毒），或實驗器具的預處理，不用于培養(yǎng)基本身的滅菌。
四、滅菌方法的選擇與優(yōu)化
根據(jù)培養(yǎng)基成分選擇：
不含熱敏感成分：優(yōu)先選高壓蒸汽滅菌法（121℃、0.1MPa，20-30 分鐘）。
含葡萄糖等易分解成分：采用低壓蒸汽滅菌（115℃、0.06MPa，20 分鐘）。
含血清、抗生素等熱敏感成分：采用過濾除菌法。
根據(jù)實驗需求選擇：
微生物培養(yǎng)實驗：對滅菌要求高，優(yōu)先選高壓蒸汽滅菌法。
細胞培養(yǎng)實驗：需保留營養(yǎng)成分活性，必須用過濾除菌法。
短期臨時使用的培養(yǎng)基：可選用流通蒸汽滅菌法。
優(yōu)化滅菌參數(shù)：
滅菌時間需根據(jù)培養(yǎng)基體積、成分調(diào)整，體積越大、有機物含量越高，滅菌時間可適當延長。
定期校準滅菌設備（如高壓蒸汽滅菌鍋的壓力表、溫度傳感器），確保參數(shù)精準。
五、滅菌效果驗證
無論采用哪種滅菌方法，都需進行滅菌效果驗證，避免因操作失誤導致滅菌失?。?/div>
無菌檢驗：取少量滅菌后的培養(yǎng)基，置于適宜溫度（細菌 37℃、真菌 28℃）下培養(yǎng) 24-48 小時，若無菌落生長，說明滅菌合格；若有菌落生長，需重新制備并排查原因。
指示劑驗證：在滅菌鍋內(nèi)放置化學指示劑（如溫度敏感試紙）或生物指示劑（如含芽孢的枯草芽孢桿菌菌片），滅菌后觀察指示劑變化，若達到預設標準（如試紙變色、菌片無活菌生長），說明滅菌有效。
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