大腸埃希氏菌平板計數(shù)培養(yǎng)的原理與操作步驟及結(jié)果判讀！
小楊 / 2025-12-04 09:56:31
大腸埃希氏菌（Escherichia coli，E. coli）的平板計數(shù)培養(yǎng)是微生物學(xué)中最基礎(chǔ)且核心的定量分析方法，廣泛應(yīng)用于食品衛(wèi)生檢測、水質(zhì)安全評估、臨床樣本分析及科研實驗等領(lǐng)域。其核心原理是通過梯度稀釋將樣品中的 E. coli 分散為單個菌落，再利用選擇性/鑒別培養(yǎng)基分離計數(shù)，最終根據(jù)菌落數(shù)和稀釋倍數(shù)推算原始樣品中的活菌濃度（單位：CFU/mL 或 CFU/g）。
以下是詳細(xì)、可執(zhí)行的操作指南，包括原理、材料、步驟、結(jié)果判讀及注意事項，兼顧基礎(chǔ)操作與專業(yè)優(yōu)化要點：
一、核心原理與培養(yǎng)基選擇
1、計數(shù)原理
樣品經(jīng)系列梯度稀釋后，取適量稀釋液涂布于固體培養(yǎng)基表面，單個活菌在適宜條件下生長繁殖形成肉眼可見的單菌落（理論上 1 個菌落對應(yīng) 1 個活菌，即 Colony-Forming Unit, CFU）。通過計數(shù)平板上的典型菌落數(shù)，結(jié)合稀釋倍數(shù)和涂布體積，計算原始樣品中的 E. coli 濃度：計算公式：
菌濃度（CFU/mL）= 涂布體積（mL）平板上的典型菌落數(shù)×稀釋倍數(shù)
?
2、培養(yǎng)基選擇（關(guān)鍵：選擇性 + 鑒別性）
E. coli 為革蘭氏陰性菌，兼性厭氧，能發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣，可通過以下培養(yǎng)基篩選鑒別：
培養(yǎng)基類型 代表培養(yǎng)基 選擇性成分 鑒別成分 E. coli 典型特征 適用場景
基礎(chǔ)鑒別培養(yǎng)基 麥康凱培養(yǎng)基（MacConkey） 膽鹽（抑制革蘭氏陽性菌） 乳糖、中性紅（pH 指示劑） 紅色菌落（發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸，使指示劑變紅），菌落較大、光滑濕潤 快速篩選，適合初步計數(shù)
強(qiáng)選擇性培養(yǎng)基 伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基（EMB） 伊紅、美藍(lán)（抑制革蘭氏陽性菌） 乳糖 紫黑色菌落，中心有金屬光澤（發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸，伊紅美藍(lán)形成復(fù)合物） 精準(zhǔn)鑒別，食品/水質(zhì)檢測首選
高選擇性培養(yǎng)基 遠(yuǎn)藤氏培養(yǎng)基 堿性復(fù)紅、亞硫酸鈉（抑制雜菌） 乳糖 深紅色菌落，周圍有紅色暈圈（產(chǎn)酸使培養(yǎng)基變紅） 復(fù)雜樣品（如污水、糞便）的分離計數(shù)
二、實驗材料準(zhǔn)備
1、樣品與試劑
樣品：液體樣品（水、飲料、發(fā)酵液）或固體樣品（食品、糞便、土壤）；
培養(yǎng)基：EMB 培養(yǎng)基或麥康凱培養(yǎng)基（干粉，按說明書配制）；
稀釋液：無菌生理鹽水（0.85% NaCl）或 LB 液體培養(yǎng)基（用于維持細(xì)菌活性）；
輔助試劑：75% 酒精（消毒）、無菌水（空白對照）；
染色試劑（可選，用于菌落驗證）：革蘭氏染色液（結(jié)晶紫、碘液、脫色液、番紅）。
2、器材
無菌器材：培養(yǎng)皿（90mm）、移液管（1mL、10mL）、離心管（1.5mL 或 50mL）、三角燒瓶、酒精燈、接種環(huán)；
設(shè)備：超凈工作臺、恒溫培養(yǎng)箱（37℃）、高壓蒸汽滅菌鍋、漩渦振蕩器、天平、移液器（10μL~10mL）。
三、詳細(xì)操作步驟（以液體樣品為例，固體樣品需前處理）
1、實驗前準(zhǔn)備（無菌操作核心）
培養(yǎng)基滅菌：按說明書配制 EMB 培養(yǎng)基（如 1L 水 + 37.5g 干粉，煮沸溶解），分裝后 121℃高壓蒸汽滅菌 15min，冷卻至 50~60℃時倒平板（每皿約 20mL），倒置凝固后備用（4℃冷藏可保存 1 周）；
稀釋液滅菌：無菌生理鹽水分裝至離心管（每管 9mL），121℃滅菌 15min；
器材滅菌：移液管、培養(yǎng)皿、接種環(huán)等經(jīng)干熱滅菌（160℃，2h）或高壓滅菌。
2、樣品梯度稀釋（關(guān)鍵：避免交叉污染）
目的：將高濃度樣品稀釋至“每涂布 0.1~0.2mL 后，平板上菌落數(shù)在 30~300 個”（此范圍為菌落計數(shù)的有效區(qū)間，避免菌落重疊或過少導(dǎo)致誤差）。
液體樣品（如飲用水）：
取 1mL 樣品，注入含 9mL 無菌生理鹽水的離心管中，漩渦振蕩器振蕩 30s（充分混勻），制成 10?¹ 稀釋液；
從 10?¹ 稀釋液中取 1mL，注入新的 9mL 無菌生理鹽水，振蕩混勻，制成 10?² 稀釋液；
重復(fù)上述操作，依次制備 10?³、10??、10??、10??等梯度稀釋液（根據(jù)樣品污染程度調(diào)整，如污水需稀釋至 10??~10??，純凈水可稀釋至 10?¹~10?³）；
每步稀釋后更換新移液管，避免交叉污染。
固體樣品（如肉類、糞便）：
稱取 10g 樣品，放入含 90mL 無菌生理鹽水的三角燒瓶中，振蕩 30min（或均質(zhì)器均質(zhì) 2min），制成 10?¹ 勻漿稀釋液；
靜置 5min（讓固體顆粒沉降），取上清液按液體樣品步驟繼續(xù)梯度稀釋。
3、涂布平板
取 3 個無菌培養(yǎng)皿，分別標(biāo)記稀釋倍數(shù)（如 10??、10??、10??）和樣品名稱；
用無菌移液器吸取 0.1mL 對應(yīng)稀釋液，滴加至培養(yǎng)皿中央（涂布體積建議 0.1~0.2mL，過多易導(dǎo)致菌落重疊）；
點燃酒精燈，將無菌玻璃涂布棒在火焰上滅菌（待冷卻后使用，避免燙傷細(xì)菌），輕輕將稀釋液均勻涂抹在培養(yǎng)基表面（從平板邊緣向中心螺旋式涂抹，確保稀釋液覆蓋整個平板）；
重復(fù)操作，每個稀釋倍數(shù)做 3 個平行平板（減少偶然誤差）；
另取 1 個培養(yǎng)皿，滴加 0.1mL 無菌生理鹽水，涂布作為空白對照（驗證培養(yǎng)基和器材是否無菌）。
4、培養(yǎng)
待平板上的液體完全吸收后（約 15~30min），將培養(yǎng)皿倒置（避免冷凝水滴落污染菌落）；
放入 37℃恒溫培養(yǎng)箱，有氧培養(yǎng) 18~24h（E. coli 為兼性厭氧，有氧條件下生長更快，菌落形態(tài)更典型）；
若培養(yǎng) 24h 后菌落過小，可延長至 48h（但需注意雜菌過度生長）。
5、菌落計數(shù)與驗證
計數(shù)：選取菌落數(shù)在 30~300 個的平板，統(tǒng)計典型 E. coli 菌落數(shù)（EMB 培養(yǎng)基上為紫黑色帶金屬光澤的菌落，麥康凱培養(yǎng)基上為紅色光滑菌落）；
若平板上有蔓延生長的菌落，需舍棄該平板；
空白對照平板應(yīng)無菌落生長，若有菌落則實驗無效，需重新操作。
驗證（可選，提高準(zhǔn)確性）：
挑取 3~5 個典型菌落，進(jìn)行革蘭氏染色（E. coli 為革蘭氏陰性短桿菌）；
接種至乳糖發(fā)酵管（含溴甲酚紫指示劑），37℃培養(yǎng) 24h，觀察是否產(chǎn)酸產(chǎn)氣（E. coli 發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣，使培養(yǎng)基變黃并產(chǎn)生氣泡）。
6、結(jié)果計算
先計算每個稀釋倍數(shù)下 3 個平行平板的平均菌落數(shù)；
選擇平均菌落數(shù)在 30~300 之間的稀釋倍數(shù)進(jìn)行計算（若多個稀釋倍數(shù)符合要求，取平均值）；
示例：若 10??稀釋液的 3 個平板平均菌落數(shù)為 120 個，涂布體積 0.1mL，則：
菌濃度 = 120 × 10? / 0.1 = 1.2×10? CFU/mL；
結(jié)果表示：若樣品中菌濃度極低（如純凈水），可表示為“＜10 CFU/mL”（未檢出）。
四、關(guān)鍵注意事項（避免實驗誤差和失敗）
1、無菌操作規(guī)范
所有操作需在超凈工作臺中進(jìn)行，操作人員需洗手消毒，佩戴無菌手套和口罩；
移液管、涂布棒等器材需徹底滅菌，避免雜菌污染；
稀釋過程中，每步振蕩混勻需充分（至少 30s），確保細(xì)菌均勻分散。
2、稀釋倍數(shù)選擇
若稀釋倍數(shù)過高，平板上菌落數(shù)＜30，誤差較大；稀釋倍數(shù)過低，菌落數(shù)＞300，菌落重疊難以計數(shù)；
未知樣品建議多設(shè)置 3~4 個稀釋梯度（如 10?³~10??），確保有符合計數(shù)要求的平板。
3、培養(yǎng)基與培養(yǎng)條件
培養(yǎng)基倒平板后需倒置凝固，避免表面有水珠；
培養(yǎng)溫度嚴(yán)格控制在 37℃（E. coli 最適生長溫度），溫度過高（＞40℃）或過低（＜35℃）會影響菌落形態(tài)和生長速度；
培養(yǎng)時間不可過長（超過 48h），否則雜菌會過度生長，掩蓋 E. coli 菌落。
4、菌落鑒別準(zhǔn)確性
避免將非典型菌落計入（如 EMB 培養(yǎng)基上無金屬光澤的紫黑色菌落可能是克雷伯氏菌，需排除）；
復(fù)雜樣品（如污水、糞便）建議結(jié)合革蘭氏染色和乳糖發(fā)酵實驗驗證，減少假陽性。
5、誤差控制
平行平板數(shù)不少于 3 個，若平行平板間菌落數(shù)差異過大（相對偏差＞15%），需重新實驗；
涂布時確保稀釋液均勻分布，避免局部菌落密集。
五、常見問題與解決方案
問題現(xiàn)象 可能原因 解決方案
空白對照平板有菌落 培養(yǎng)基、稀釋液或器材滅菌不徹底 重新滅菌所有器材和試劑，更換新配制的培養(yǎng)基
平板上無菌落生長 稀釋倍數(shù)過高；樣品中無 E. coli；涂布時涂布棒溫度過高 調(diào)整稀釋梯度；重新取樣；涂布棒冷卻后使用
菌落重疊嚴(yán)重 涂布體積過多；稀釋倍數(shù)過低；涂抹不均勻 減少涂布體積（0.1mL 為宜）；提高稀釋倍數(shù)；優(yōu)化涂抹方式
無典型 E. coli 菌落 培養(yǎng)基配方錯誤；培養(yǎng)溫度/時間不當(dāng) 檢查培養(yǎng)基成分；嚴(yán)格控制 37℃培養(yǎng) 18~24h
平行平板菌落數(shù)差異大 稀釋時未混勻；移液誤差；涂布不均 稀釋時充分振蕩；校準(zhǔn)移液器；規(guī)范涂布操作
六、應(yīng)用場景擴(kuò)展
食品衛(wèi)生檢測：如飲用水中 E. coli 計數(shù)（國家標(biāo)準(zhǔn) GB 5749-2022 規(guī)定，生活飲用水中 E. coli 不得檢出）、乳制品、肉制品中的致病菌限量檢測；
臨床診斷：尿液、糞便樣本中 E. coli 計數(shù)，輔助診斷泌尿系統(tǒng)感染、腸道感染等；
科研實驗：E. coli 工程菌株的生長曲線測定、發(fā)酵工藝優(yōu)化、抗菌藥物 MIC（最低抑菌濃度）測定等。
通過以上步驟，可實現(xiàn)
E. coli 的精準(zhǔn)平板計數(shù)。核心要點是無菌操作、梯度稀釋的準(zhǔn)確性、培養(yǎng)基的選擇性鑒別，以及對典型菌落的正確判讀。若需針對特定樣品或特殊需求（如快速計數(shù)）進(jìn)行優(yōu)化，可進(jìn)一步調(diào)整稀釋方案、培養(yǎng)基類型或培養(yǎng)條件。
歡迎訪問
微生物菌種查詢網(wǎng)，本站隸屬于北京百歐博偉生物技術(shù)有限公司，單位現(xiàn)提供微生物菌種及其細(xì)胞等相關(guān)產(chǎn)品查詢、咨詢、訂購、售后服務(wù)！與國內(nèi)外多家研制單位，生物醫(yī)藥，第三方檢測機(jī)構(gòu)，科研院所有著良好穩(wěn)定的長期合作關(guān)系！歡迎廣大客戶來詢！
下載附件
上一篇：空腸彎曲桿菌的培養(yǎng)條件與鑒定方法及致病性與應(yīng)用場景！
下一篇：培養(yǎng)基滅菌處理的常用方法與操作流程及適用場景！