蠟樣芽胞桿菌的特異性分子生物學方法及技術細節(jié)有哪些？
小楊 / 2025-12-18 09:34:29
蠟樣芽胞桿菌（Bacillus cereus）的特異性分子生物學方法，核心是基于菌株特異性基因或毒力基因的檢測技術，可實現(xiàn)快速、精準的菌種鑒定，同時還能評估菌株的致病性。以下是目前主流的特異性分子生物學方法及技術細節(jié)：
一、聚合酶鏈式反應（PCR）及衍生技術
這是最常用、最成熟的分子鑒定方法，核心是針對
蠟樣芽胞桿菌的特異性保守基因或毒力相關基因設計引物，通過擴增產物的有無及大小判定結果。
1、常規(guī) PCR（終點 PCR）
靶標基因選擇
保守看家基因：用于菌種的分類鑒定，區(qū)分于其他芽孢桿菌
16S rRNA 基因：芽孢桿菌屬的通用鑒定基因，
蠟樣芽胞桿菌的 16S rRNA 序列與同屬菌株（如
枯草芽孢桿菌）有差異，測序比對后可確證；但分辨率有限，常需結合其他基因。
gyrB 基因（促旋酶 B 亞基基因）：進化速率快于 16S rRNA，是芽孢桿菌種級鑒定的核心靶標，特異性高于 16S rRNA。
rpoB 基因（RNA 聚合酶 β 亞基基因）：序列保守性適中，可有效區(qū)分蠟樣芽胞桿菌與近緣種（如
炭疽芽孢桿菌、
蘇云金芽孢桿菌）。
毒力相關基因：同時鑒定菌種和致病性，適用于食品或臨床樣本
腸毒素基因：如溶血素 BL 基因、非溶血性腸毒素基因、腸毒素 FM 基因，幾乎所有致病性蠟樣芽胞桿菌均攜帶這些基因。
嘔吐毒素基因：cesA/cesB（
蠟樣芽胞桿菌毒素基因），僅產嘔吐毒素的菌株攜帶，是食源性嘔吐型中毒菌株的特異性標志。
技術流程：提取菌株基因組 DNA → 特異性引物擴增 → 瓊脂糖凝膠電泳 → 觀察目標條帶大小。
優(yōu)勢：操作簡單、成本低、特異性強，適合實驗室常規(guī)檢測。
2、實時熒光定量 PCR（qPCR）
原理：在常規(guī) PCR 基礎上加入熒光探針或染料，實時監(jiān)測擴增過程，通過 Ct 值判定靶標基因的存在，還可實現(xiàn)定量分析。
應用場景：適用于復雜樣本的快速檢測，可直接檢測未分離培養(yǎng)的樣本，縮短檢測時間至 2~4h。
特異性探針設計：針對gyrB或毒力基因的特異性序列設計 TaqMan 探針，進一步提高檢測準確性，避免非特異性擴增的干擾。
多重 PCR
原理：在同一反應體系中加入多對特異性引物，同時擴增多個靶標基因。
優(yōu)勢：一次反應即可完成菌種鑒定 + 致病性評估，大幅提高檢測效率，適合大規(guī)模樣本篩查。
二、環(huán)介導等溫擴增技術（LAMP）
原理：針對靶基因的 6 個特異性區(qū)域設計 4 條引物，在等溫條件（60~65℃）下，利用鏈置換 DNA 聚合酶實現(xiàn)靶標基因的快速擴增，產物可通過肉眼觀察渾濁度或熒光顯色判定。
靶標選擇：常選用gyrB、nheA等特異性基因。
優(yōu)勢：無需昂貴的 PCR 儀，操作簡便、擴增速度快（30~60min 完成）、特異性高，適合現(xiàn)場快速檢測。
局限性：引物設計復雜，易出現(xiàn)非特異性擴增，需嚴格優(yōu)化反應條件。
三、核酸測序技術
該技術是分子鑒定的金標準，通過測定靶基因或全基因組序列，實現(xiàn)高精度的種級鑒定和菌株分型。
1、靶向基因測序
方法：對 PCR 擴增的特異性基因進行 Sanger 測序，將測序結果與NCBI 等數(shù)據(jù)庫中的蠟樣芽胞桿菌標準菌株序列比對。
判定標準：序列同源性≥99% 即可確認為蠟樣芽胞桿菌；同源性較低時，可結合多個基因序列進行多基因序列分析（MLSA）。
2、全基因組測序（WGS）
方法：對菌株的全基因組 DNA 進行高通量測序，通過基因組組裝、基因注釋和比較基因組分析，確定菌株的分類地位。
優(yōu)勢：分辨率最高，不僅能鑒定菌種，還能分析菌株的進化關系、毒力基因簇、耐藥基因等，適用于流行病學調查。
局限性：成本高、數(shù)據(jù)分析復雜，需專業(yè)的生物信息學平臺支持。
四、其他分子分型技術
這類技術主要用于菌株的分子分型，輔助流行病學研究，區(qū)分不同來源的蠟樣芽胞桿菌菌株：
脈沖場凝膠電泳（PFGE）：通過限制性內切酶消化基因組 DNA，利用脈沖場電泳分離不同大小的 DNA 片段，形成特異性指紋圖譜。該技術是芽孢桿菌分型的“金標準”，可用于追蹤菌株的傳播路徑。
多位點序列分型（MLST）：基于 7 個管家基因的序列變異進行分型，結果可在公共數(shù)據(jù)庫中比對，實現(xiàn)全球范圍內的菌株同源性分析。
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