樣品中活菌的計(jì)數(shù)和檢測：原理、方法、操作及質(zhì)量控制！
小楊 / 2025-12-18 10:06:42
百歐博偉生物：活菌計(jì)數(shù)與檢測是生命科學(xué)、食品工業(yè)、環(huán)境監(jiān)測、醫(yī)藥研發(fā)等領(lǐng)域的核心技術(shù)，核心目標(biāo)是精準(zhǔn)量化樣品中具有代謝活性、能夠增殖的微生物數(shù)量（區(qū)別于死菌和非細(xì)胞顆粒）。其方法學(xué)需根據(jù)樣品類型、微生物特性、計(jì)數(shù)范圍（10¹~10? CFU/mL）及檢測目的（定量/定性、快速篩查/精準(zhǔn)計(jì)數(shù)）選擇，以下是全面且結(jié)構(gòu)化的技術(shù)總結(jié)：
一、核心原理與分類框架
1、核心原理
活菌具有完整的代謝系統(tǒng)和增殖能力，可通過以下兩類邏輯實(shí)現(xiàn)檢測：
增殖依賴型：利用活菌在適宜培養(yǎng)基中生長形成可觀察的菌落（平板計(jì)數(shù)）、濁度變化（比濁法）或代謝產(chǎn)物，間接量化活菌數(shù)量；
活性標(biāo)記型：通過特異性染料（如活菌/死菌鑒別染料）或探針（如靶向活菌代謝酶的底物）標(biāo)記活菌，直接通過顯微鏡或流式細(xì)胞儀計(jì)數(shù)。
2、方法分類與適用場景總覽
方法類型 代表性技術(shù) 檢測范圍 優(yōu)點(diǎn) 缺點(diǎn) 適用場景
傳統(tǒng)培養(yǎng)法 平板菌落計(jì)數(shù)法（傾注/涂布） 10²~10? CFU/mL 經(jīng)典準(zhǔn)確、成本低、可分離純菌 耗時(shí)（18~72h）、漏檢難培養(yǎng)菌 科研、食品、水質(zhì)常規(guī)檢測
最大概率數(shù)法（MPN） 10?~10? CFU/mL 適用于低濃度、不均勻樣品 誤差大、操作繁瑣 糞便、污水、食品中致病菌篩查
快速培養(yǎng)法 濁度法（比濁法） 10?~10? CFU/mL 快速（4~8h）、可實(shí)時(shí)監(jiān)測 靈敏度低、易受雜質(zhì)干擾 工業(yè)發(fā)酵過程監(jiān)測
微平板法（微量肉湯稀釋） 10³~10? CFU/mL 高通量、省試劑 需專用設(shè)備、結(jié)果需驗(yàn)證 藥物敏感性測試、批量樣品篩查
非培養(yǎng)快速法 熒光染色計(jì)數(shù)法（LIVE/DEAD） 10?~10? CFU/mL 快速（30min）、直接計(jì)數(shù) 無法區(qū)分可培養(yǎng)性、需熒光顯微鏡 應(yīng)急檢測、活菌/死菌比例分析
ATP 生物發(fā)光法 10³~10? CFU/mL 超快速（5~15min）、操作簡便 易受非微生物 ATP 干擾 食品衛(wèi)生快速篩查、表面潔凈度檢測
流式細(xì)胞術(shù)（FCM） 10?~10¹? CFU/mL 高通量、可分型、靈敏度高 設(shè)備昂貴、樣品需預(yù)處理 科研、臨床樣本快速檢測
定量 PCR（qPCR，活菌特異性） 10²~10? CFU/mL 高特異性、快速（2~4h） 無法區(qū)分代謝活性、易受抑制物干擾 致病菌靶向檢測、環(huán)境微生物監(jiān)測
二、常用方法詳細(xì)操作流程
1、平板菌落計(jì)數(shù)法（GB 標(biāo)準(zhǔn)方法，最常用）
（1）原理
活菌在固體培養(yǎng)基上生長形成單菌落，通過菌落數(shù)推算樣品中活菌濃度（CFU： colony-forming unit，菌落形成單位）。
（2）操作步驟
樣品稀釋：
液體樣品：取 1mL 樣品加入 9mL 無菌生理鹽水（或 PBS），梯度稀釋至適宜濃度（最終平板菌落數(shù)為 30~300 個(gè)）；
固體樣品：稱取 10g 樣品加入 90mL 無菌稀釋液，均質(zhì)器打碎后梯度稀釋。
接種與培養(yǎng)：
傾注法：取 0.1~1mL 稀釋液加入無菌培養(yǎng)皿，倒入 45~50℃融化的固體培養(yǎng)基（如 LB、營養(yǎng)瓊脂），快速搖勻，凝固后倒置培養(yǎng)（需氧菌 37℃ 18~24h，厭氧菌需厭氧箱培養(yǎng) 24~72h）；
涂布法：先倒好培養(yǎng)基并凝固，取 0.1mL 稀釋液均勻涂布于平板表面，待液體吸收后倒置培養(yǎng)。
計(jì)數(shù)與計(jì)算：
選擇菌落數(shù) 30~300 的平板，統(tǒng)計(jì)菌落總數(shù)；
活菌濃度（CFU/mL）= 平板菌落數(shù) × 稀釋倍數(shù) ÷ 接種體積。
（3）關(guān)鍵注意事項(xiàng)
稀釋過程需無菌操作，避免交叉污染；
梯度稀釋時(shí)每步需充分搖勻（至少 10 秒），保證微生物均勻分布；
培養(yǎng)基溫度需控制在 45~50℃，避免燙傷微生物；
若菌落重疊，需選擇稀釋度更高的平板重新計(jì)數(shù)。
2、最大概率數(shù)法（MPN 法）
（1）原理
基于微生物在稀釋液中隨機(jī)分布的概率，通過觀察不同稀釋度試管中微生物生長的陽性管數(shù)，查表推算活菌濃度。
（2）操作步驟
樣品梯度稀釋（如 10?¹~10??）；
每個(gè)稀釋度取 3~5 支試管，每管加入 1mL 稀釋液，再加入 9mL 選擇性培養(yǎng)基（如檢測大腸菌群用乳糖膽鹽培養(yǎng)基）；
培養(yǎng)后觀察陽性管（如大腸菌群產(chǎn)酸產(chǎn)氣），根據(jù)陽性管數(shù)對照 MPN 表，計(jì)算樣品中活菌濃度。
3、ATP 生物發(fā)光法（快速篩查首選）
（1）原理
活菌代謝產(chǎn)生的 ATP 與熒光素 - 熒光素酶反應(yīng)，釋放熒光強(qiáng)度與 ATP 含量（即活菌數(shù)量）呈正相關(guān)，通過熒光檢測儀定量。
（2）操作步驟
樣品處理：取一定量樣品，加入 ATP 提取液，裂解活菌釋放 ATP；
反應(yīng)：加入熒光素 - 熒光素酶試劑，避光孵育 30 秒；
檢測：用熒光光度計(jì)讀取相對熒光強(qiáng)度（RLU），通過標(biāo)準(zhǔn)曲線換算活菌濃度。
（3）關(guān)鍵注意事項(xiàng)
需去除樣品中游離 ATP（如食品中的植物 ATP），可加入 ATP 酶預(yù)處理；
提取液需新鮮配制，避免酶活性喪失。
4、熒光染色計(jì)數(shù)法（LIVE/DEAD 染色）
（1）原理
活菌細(xì)胞膜完整，可攝取綠色熒光染料；死菌細(xì)胞膜破損，紅色熒光染料進(jìn)入染色，通過熒光顯微鏡區(qū)分活菌與死菌。
（2）操作步驟
樣品固定：取少量樣品，用 4% 多聚甲醛固定 10 分鐘（可選，增強(qiáng)細(xì)胞穩(wěn)定性）；
染色：加入 SYTO 9 和 PI 混合染料，室溫避光孵育 15 分鐘；
觀察：熒光顯微鏡下計(jì)數(shù)綠色熒光細(xì)胞（活菌）和紅色熒光細(xì)胞（死菌），計(jì)算活菌比例和濃度。
三、樣品預(yù)處理關(guān)鍵技術(shù)
不同樣品基質(zhì)復(fù)雜，需針對性預(yù)處理，避免雜質(zhì)干擾或微生物損失：
1、液體樣品（水、飲料、發(fā)酵液）
澄清樣品：直接梯度稀釋；
渾濁樣品（如污水、果汁）：先離心（3000r/min，5min）去除大顆粒，取上清稀釋；
含抑菌物質(zhì)樣品：加入中和劑或用無菌水洗滌去除抑制劑。
2、固體樣品（食品、土壤、糞便）
食品（如肉類、乳制品）：稱取樣品 + 無菌稀釋液，用均質(zhì)器（8000~10000r/min，2min）均質(zhì)，制成勻漿后稀釋；
土壤：稱取 10g 土壤 + 90mL 無菌水，振蕩（200r/min，30min）分散微生物，靜置后取上清稀釋；
糞便：用無菌生理鹽水梯度稀釋，加入玻璃珠振蕩破碎糞球，避免微生物包裹。
3、氣溶膠樣品（空氣微生物）
撞擊法：用空氣采樣器將氣溶膠撞擊到培養(yǎng)基平板上，直接培養(yǎng)計(jì)數(shù)；
液體吸收法：用無菌水吸收空氣微生物，再通過平板計(jì)數(shù)或其他方法檢測。
四、質(zhì)量控制與結(jié)果驗(yàn)證
1、實(shí)驗(yàn)質(zhì)量控制（QC）要點(diǎn)
空白對照：每批實(shí)驗(yàn)設(shè)置無菌稀釋液 + 培養(yǎng)基的空白平板/試管，確保無外源污染；
平行實(shí)驗(yàn)：每個(gè)稀釋度設(shè)置 2~3 個(gè)平行平板/試管，結(jié)果取平均值，相對偏差≤10%；
標(biāo)準(zhǔn)曲線：快速方法需用標(biāo)準(zhǔn)菌株制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，R²≥0.99；
培養(yǎng)基質(zhì)量：培養(yǎng)基需無菌、凝固良好、pH 適宜（細(xì)菌 7.2~7.4，真菌 5.6~6.0），接種標(biāo)準(zhǔn)菌株驗(yàn)證生長性能。
2、結(jié)果準(zhǔn)確性判斷
平板計(jì)數(shù)：菌落數(shù)需在 30~300 范圍內(nèi)，超出則需調(diào)整稀釋度重新檢測；
MPN 法：陽性管數(shù)需與 MPN 表匹配，若出現(xiàn)異常陽性管（如高稀釋度陽性而低稀釋度陰性），需重復(fù)實(shí)驗(yàn)；
快速方法：結(jié)果需與平板計(jì)數(shù)法對比，偏差≤2 個(gè)數(shù)量級（如 ATP 法結(jié)果需在平板計(jì)數(shù)的 10?²~10² 倍范圍內(nèi)）；
難培養(yǎng)菌：若懷疑樣品中存在難培養(yǎng)菌，可結(jié)合多種方法驗(yàn)證。
五、常見問題與排查
1、平板計(jì)數(shù)菌落數(shù)過多/過少
原因：稀釋度選擇不當(dāng)；
排查：調(diào)整稀釋度（菌落數(shù) <30 則降低稀釋倍數(shù)，>300 則提高稀釋倍數(shù)），確保每平板菌落數(shù)在 30~300 之間。
2、空白對照出現(xiàn)菌落
原因：稀釋液、培養(yǎng)基、實(shí)驗(yàn)器材污染，或無菌操作不當(dāng)；
排查：重新滅菌實(shí)驗(yàn)器材和培養(yǎng)基，嚴(yán)格執(zhí)行無菌操作，更換新的稀釋液重復(fù)實(shí)驗(yàn)。
3、快速方法與平板計(jì)數(shù)結(jié)果偏差大
原因：樣品中存在非培養(yǎng)活菌、死菌 DNA 殘留（qPCR）、非微生物 ATP（ATP 法）；
排查：結(jié)合活菌特異性染料或酶處理，驗(yàn)證樣品中微生物活性狀態(tài)。
4、菌落形態(tài)不典型/重疊
原因：培養(yǎng)基選擇不當(dāng)、培養(yǎng)條件不適宜、接種量過大；
排查：更換針對性培養(yǎng)基（如選擇性培養(yǎng)基），調(diào)整培養(yǎng)溫度/時(shí)間，降低接種量或提高稀釋倍數(shù)。
六、方法選擇決策流程
明確檢測目的：定量精準(zhǔn)度要求（科研/常規(guī)檢測）→ 檢測時(shí)間（緊急篩查/常規(guī)監(jiān)測）→ 樣品類型（液體/固體/氣溶膠）；
優(yōu)先選擇原則：
常規(guī)定量、需分離純菌：平板菌落計(jì)數(shù)法；
低濃度、不均勻樣品：MPN 法；
快速篩查、無需精準(zhǔn)定量：ATP 生物發(fā)光法；
活菌/死菌比例分析：熒光染色計(jì)數(shù)法；
靶向致病菌檢測、高特異性要求：活菌特異性 qPCR；
方法驗(yàn)證：重要樣品需用 2 種以上方法交叉驗(yàn)證（如平板計(jì)數(shù) + FCM），確保結(jié)果可靠性。
七、應(yīng)用場景實(shí)例
食品工業(yè)：牛奶中大腸桿菌計(jì)數(shù)（平板計(jì)數(shù)法）、肉制品菌落總數(shù)快速篩查（ATP 法）；
環(huán)境監(jiān)測：污水中總活菌數(shù)（MPN 法）、土壤中功能菌（如固氮菌）定量（qPCR 法）；
醫(yī)藥研發(fā)：抗生素最低抑菌濃度（MIC）測定（微平板法）、益生菌制劑活菌含量檢測（平板計(jì)數(shù)法）；
臨床診斷：痰液中肺炎鏈球菌計(jì)數(shù)（FCM 法）、糞便中沙門氏菌篩查（MPN + 選擇性平板）。
通過以上系統(tǒng)化的方法選擇、操作規(guī)范和質(zhì)量控制，可實(shí)現(xiàn)不同樣品中活菌的精準(zhǔn)、高效檢測，滿足科研與工業(yè)生產(chǎn)的多樣化需求。
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