小鼠原代結(jié)腸成纖維細(xì)胞培養(yǎng)方法的準(zhǔn)備工作及操作步驟！
小楊 / 2025-12-19 09:20:42
一、實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備
1、試劑與耗材
培養(yǎng)基：DMEM/F12 培養(yǎng)基（含 L - 谷氨酰胺），添加 10% 胎牛血清（FBS，需熱滅活）、100 U/mL 青霉素、100 μg/mL 鏈霉素；也可選用原代成纖維細(xì)胞專(zhuān)用培養(yǎng)基提升細(xì)胞存活率。
消化液：0.1% 膠原酶 I + 0.05% 胰酶 - EDTA 混合液（用無(wú)血清 DMEM/F12 配制，過(guò)濾除菌）；PBS 緩沖液（不含鈣鎂離子）。
耗材：無(wú)菌手術(shù)器械（眼科剪、眼科鑷、止血鉗）、60 mm 細(xì)胞培養(yǎng)皿、100 目細(xì)胞篩網(wǎng)、離心管、移液管、無(wú)菌紗布。
其他：75% 酒精、含雙抗的 PBS、細(xì)胞凍存液（90% FBS + 10% DMSO）。
2、實(shí)驗(yàn)環(huán)境
超凈工作臺(tái)紫外滅菌 30 min；培養(yǎng)箱預(yù)熱至 37℃、5% CO?、飽和濕度。
二、操作步驟
1、小鼠結(jié)腸組織取材（無(wú)菌操作）
選取 6-8 周齡 SPF 級(jí)小鼠，脫頸處死，75% 酒精浸泡全身消毒 3-5 min，轉(zhuǎn)移至超凈臺(tái)。
無(wú)菌打開(kāi)腹腔，用止血鉗夾取結(jié)腸組織（從盲腸末端至直腸段），放入含雙抗的 PBS 平皿中，反復(fù)漂洗 3 次，去除表面血液與脂肪組織。
用眼科剪縱向剪開(kāi)結(jié)腸，用 PBS 沖洗腸腔內(nèi)容物；再用無(wú)菌紗布輕輕刮擦腸黏膜表面，去除大部分上皮細(xì)胞（減少后續(xù)雜細(xì)胞污染）。
2、組織剪碎與酶解消化
將預(yù)處理后的結(jié)腸組織剪切成 1-2 mm³ 的小塊，轉(zhuǎn)移至 15 mL 離心管，加入 5-8 mL 膠原酶 I - 胰酶混合消化液，37℃ 搖床振蕩消化 60-90 min（每 15 min 輕輕顛倒混勻 1 次）。
消化終點(diǎn)判斷：組織塊邊緣模糊、溶液變渾濁，即可終止消化；若消化過(guò)度會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞活性下降。
加入等體積含血清的培養(yǎng)基，中和消化酶活性；用 100 目細(xì)胞篩網(wǎng)過(guò)濾，去除未消化的組織碎片，收集濾液。
3、細(xì)胞離心與接種
濾液 1000 r/min 離心 5 min，棄上清；用含 10% FBS 的完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞沉淀，輕輕吹打混勻。
將細(xì)胞懸液接種至 60 mm 細(xì)胞培養(yǎng)皿，每皿加入 3 mL 完全培養(yǎng)基，輕輕晃動(dòng)培養(yǎng)皿使細(xì)胞均勻分布。
放入培養(yǎng)箱，靜置培養(yǎng) 24 h，期間不挪動(dòng)培養(yǎng)皿，利于細(xì)胞貼壁。
4、細(xì)胞純化與換液
差速貼壁純化：培養(yǎng) 24 h 后，吸棄舊培養(yǎng)基（未貼壁的上皮細(xì)胞、免疫細(xì)胞會(huì)隨培養(yǎng)基被去除），用 PBS 輕輕漂洗 1 次，加入新鮮完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。
后續(xù)每 2-3 d 換液 1 次，觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)：原代結(jié)腸成纖維細(xì)胞貼壁后呈梭形或星形，3-5 d 后可見(jiàn)細(xì)胞克隆，7-10 d 細(xì)胞匯合度可達(dá) 80%-90%。
5、傳代培養(yǎng)
當(dāng)細(xì)胞匯合度達(dá) 80%-90% 時(shí)進(jìn)行傳代，避免過(guò)度匯合導(dǎo)致細(xì)胞老化。
吸棄培養(yǎng)基，用 PBS 漂洗 2 次；加入 1 mL 0.25% 胰酶 - EDTA，覆蓋細(xì)胞表面，37℃ 孵育 1-2 min。
顯微鏡下觀察，當(dāng)細(xì)胞回縮變圓、細(xì)胞間隙增大時(shí)，立即加入含血清培養(yǎng)基中和胰酶。
用移液管輕輕吹打細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液，1000 r/min 離心 5 min，棄上清。
完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，按 1:2 或 1:3 的比例接種至新培養(yǎng)皿，補(bǔ)充培養(yǎng)基后放回培養(yǎng)箱培養(yǎng)。
注意：原代細(xì)胞傳代次數(shù)建議不超過(guò) 5-8 代，超過(guò)代數(shù)后細(xì)胞易出現(xiàn)老化、形態(tài)改變及功能衰退。
6、凍存與復(fù)蘇
凍存：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，按傳代方法消化收集，離心后用凍存液重懸，調(diào)整細(xì)胞密度至 1×10? - 5×10? 個(gè) /mL；分裝至凍存管，程序降溫（4℃ 30 min→-20℃ 1 h→-80℃ 過(guò)夜）后轉(zhuǎn)移至液氮長(zhǎng)期保存。
復(fù)蘇：從液氮中取出凍存管，迅速放入 37℃ 水浴鍋快速搖晃解凍（1-2 min 內(nèi)完成）；離心去除凍存液，完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞后接種，24 h 后換液去除死細(xì)胞。
三、關(guān)鍵注意事項(xiàng)
雜細(xì)胞控制：上皮細(xì)胞污染是主要問(wèn)題，除了取材時(shí)刮擦黏膜，還可通過(guò)二次差速貼壁（首次貼壁 2 h 后，轉(zhuǎn)移未貼壁細(xì)胞至新皿，成纖維細(xì)胞貼壁更快）或免疫磁珠分選進(jìn)一步純化。
消化條件優(yōu)化：膠原酶與胰酶的比例、消化時(shí)間需根據(jù)組織狀態(tài)調(diào)整，過(guò)短消化細(xì)胞產(chǎn)量低，過(guò)長(zhǎng)消化細(xì)胞活性差。
培養(yǎng)環(huán)境穩(wěn)定：血清質(zhì)量對(duì)原代細(xì)胞生長(zhǎng)至關(guān)重要，建議選用批次穩(wěn)定的 FBS；避免頻繁挪動(dòng)培養(yǎng)皿，減少對(duì)細(xì)胞的機(jī)械損傷。
無(wú)菌控制：原代細(xì)胞抵抗力弱，全程嚴(yán)格無(wú)菌操作，培養(yǎng)基中可短期添加雙抗（長(zhǎng)期培養(yǎng)建議去除雙抗，避免細(xì)胞毒性）。
四、細(xì)胞鑒定要點(diǎn)
培養(yǎng)后的細(xì)胞需驗(yàn)證純度與身份，常用方法：
免疫熒光染色：波形蛋白、纖維連接蛋白，陽(yáng)性率≥90%，上皮細(xì)胞標(biāo)志物陰性。
形態(tài)學(xué)觀察：細(xì)胞呈典型梭形，匯合后呈漩渦狀排列，無(wú)上皮細(xì)胞的鋪路石樣形態(tài)。
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