大鼠關(guān)節(jié)滑膜成纖維細胞原代培養(yǎng)與傳代培養(yǎng)標準方法！
小楊 / 2026-01-12 09:21:20
一、實驗準備
1、試劑與耗材
基礎(chǔ)培養(yǎng)基：DMEM 或 RPMI-1640（低糖型更適合成纖維細胞增殖）
完全培養(yǎng)基：基礎(chǔ)培養(yǎng)基 + 10% 胎牛血清（FBS，需熱滅活） + 1% 青霉素 - 鏈霉素雙抗（終濃度 100 U/mL 青霉素、100 μg/mL 鏈霉素）
消化液：0.25% 胰蛋白酶 - 0.02% EDTA 混合液
緩沖液：無菌 PBS（不含鈣鎂離子）
其他試劑：75% 醫(yī)用酒精、無菌生理鹽水、臺盼藍染色液
耗材：無菌手術(shù)器械（眼科剪、眼科鑷、止血鉗）、6 孔/ 12 孔細胞培養(yǎng)板、離心管、移液管、超凈工作臺、CO?培養(yǎng)箱
2、實驗動物
選取 4~6 周齡 SD 或 Wistar 大鼠（體重 150~200 g），雌雄不限，SPF 級飼養(yǎng)，減少微生物污染風(fēng)險。
二、原代分離培養(yǎng)（組織塊貼壁法/酶消化法，推薦組織塊貼壁法，細胞活性更高）
方法 1：組織塊貼壁法（首選）
動物消毒與取材
大鼠脫頸處死，75% 酒精浸泡全身 5 min 消毒，轉(zhuǎn)入超凈工作臺。
無菌操作剪開膝關(guān)節(jié)皮膚與肌肉，暴露關(guān)節(jié)囊，用止血鉗夾住關(guān)節(jié)囊邊緣，剝離完整滑膜組織（呈淡紅色、半透明薄膜狀）。
用無菌 PBS 反復(fù)沖洗滑膜組織 3~5 次，去除殘留血液、脂肪和軟骨碎屑。
組織塊剪碎與接種
將洗凈的滑膜組織置于無菌培養(yǎng)皿中，用眼科剪剪切成 1 mm³ 左右的微小組織塊。
用移液管將組織塊均勻接種于 6 孔培養(yǎng)板底部，每孔接種 8~10 塊，輕輕按壓組織塊使其緊貼孔底（避免懸?。?。
靜置培養(yǎng)板 2~4 h，使組織塊初步貼壁。
加液與培養(yǎng)
沿培養(yǎng)板孔壁緩慢加入 1.5~2 mL 完全培養(yǎng)基，避免沖脫組織塊，做好標記。
將培養(yǎng)板放入 37℃、5% CO? 飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
換液：前 3 天不換液，減少組織塊脫落；第 3 天首次換液，吸棄舊培養(yǎng)基，加入新鮮完全培養(yǎng)基；之后每 2~3 天換液 1 次。
細胞爬出觀察
培養(yǎng) 5~7 天后，在倒置顯微鏡下可見梭形細胞從組織塊邊緣爬出，呈放射狀或漩渦狀生長；培養(yǎng) 10~14 天，細胞可增殖至 80%~90% 匯合度，即可進行傳代。
方法 2：酶消化法（適用于需要快速獲得大量細胞的場景）
取材與沖洗步驟同組織塊貼壁法，將滑膜組織剪碎至 1 mm³ 大小。
加入 3~5 倍體積的 0.25% 胰蛋白酶 - EDTA 消化液，37℃ 恒溫搖床消化 30~40 min，期間每隔 10 min 輕輕震蕩 1 次。
加入等體積完全培養(yǎng)基終止消化，用 200 目無菌細胞篩網(wǎng)過濾，去除未消化的組織碎片。
濾液轉(zhuǎn)入離心管，1000 r/min 離心 5 min，棄上清；用完全培養(yǎng)基重懸細胞沉淀，調(diào)整細胞密度至 1×10? 個 /mL。
接種于培養(yǎng)板，37℃、5% CO? 培養(yǎng)，24 h 后首次換液，去除未貼壁細胞，后續(xù)每 2~3 天換液 1 次，細胞匯合度達 80% 后傳代。
三、傳代培養(yǎng)
預(yù)處理：吸棄培養(yǎng)板中的舊培養(yǎng)基，用無菌 PBS 沖洗細胞層 2 次，去除殘留血清（血清會抑制胰蛋白酶活性）。
消化：每孔加入 0.5~1 mL 0.25% 胰蛋白酶 - EDTA 消化液，覆蓋細胞層，37℃ 孵育 1~2 min；倒置顯微鏡下觀察，當(dāng)細胞形態(tài)變圓、細胞間隙增大時，立即加入完全培養(yǎng)基終止消化。
吹打與離心：用移液管輕輕吹打細胞層，使細胞完全脫落，形成單細胞懸液；將懸液轉(zhuǎn)入離心管，1000 r/min 離心 5 min，棄上清。
重懸與接種：用完全培養(yǎng)基重懸細胞沉淀，調(diào)整細胞密度至 5×10? 個 /mL，按 1:2 的比例接種于新的培養(yǎng)板（RSyF 傳代比例不宜過高，否則影響增殖）。
培養(yǎng)：接種后放入培養(yǎng)箱，24 h 后換液，后續(xù)每 2~3 天換液 1 次，細胞匯合度達 80% 時可再次傳代或用于后續(xù)實驗。
四、凍存與復(fù)蘇（可選，用于長期保存細胞）
1、凍存
選擇對數(shù)生長期的細胞，按傳代步驟消化、離心，棄上清。
用凍存液（90% FBS + 10% DMSO）重懸細胞，調(diào)整密度至 1×10? 個 /mL，轉(zhuǎn)入凍存管。
程序降溫：4℃ 放置 30 min → -20℃ 放置 1 h → -80℃ 過夜 → 次日轉(zhuǎn)入液氮罐長期保存。
2、復(fù)蘇
從液氮罐取出凍存管，迅速放入 37℃ 水浴鍋，快速搖晃 1~2 min 至完全融化。
用移液管將細胞懸液轉(zhuǎn)入離心管，加入 5 倍體積完全培養(yǎng)基，1000 r/min 離心 5 min，棄上清（去除 DMSO，減少細胞毒性）。
完全培養(yǎng)基重懸細胞，接種于培養(yǎng)板，24 h 后換液，去除死亡細胞。
五、質(zhì)量控制與鑒定
形態(tài)學(xué)鑒定：倒置顯微鏡下觀察，RSyF 呈典型長梭形，貼壁生長，排列呈漩渦狀或平行狀，無明顯上皮樣細胞混雜。
免疫表型鑒定：采用免疫熒光或流式細胞術(shù)檢測，波形蛋白陽性（成纖維細胞標志物），CD68 陰性（巨噬細胞標志物，排除 A 型滑膜細胞污染），細胞純度應(yīng) ≥ 90%。
活力檢測：臺盼藍染色，活細胞拒染，細胞活力應(yīng) ≥ 90%。
六、常見問題及解決方案
常見問題 原因分析 解決方案
組織塊脫落，無細胞爬出 組織塊未貼緊孔底；培養(yǎng)基加入過快沖脫組織塊 接種后靜置 4~6 h 再加液；加液時沿孔壁緩慢滴加
細胞污染（細菌/真菌） 手術(shù)器械消毒不徹底；動物體表消毒不充分；培養(yǎng)基污染 嚴格無菌操作；手術(shù)器械高壓滅菌；75% 酒精浸泡動物時間不少于 5 min；培養(yǎng)基使用前檢測
細胞增殖緩慢，形態(tài)不規(guī)則 血清質(zhì)量差；傳代次數(shù)過多；培養(yǎng)溫度/CO? 濃度異常 更換優(yōu)質(zhì)胎牛血清；使用 3~5 代以內(nèi)的細胞；校準培養(yǎng)箱參數(shù)（37℃、5% CO?）
細胞混雜上皮樣細胞 取材時混入軟骨或滑膜上皮組織 取材時盡量剝離純凈滑膜組織；用 200 目篩網(wǎng)過濾細胞懸液
七、注意事項
原代培養(yǎng)的關(guān)鍵是無菌操作和組織塊貼壁，操作過程中避免反復(fù)晃動培養(yǎng)板。
胰蛋白酶消化時間不宜過長，否則會損傷細胞膜，導(dǎo)致細胞死亡。
RSyF 傳代超過 5 代后易出現(xiàn)老化，表現(xiàn)為細胞空泡增多、增殖停滯，建議實驗使用 3~5 代的細胞。
DMSO 具有細胞毒性，復(fù)蘇時需徹底離心去除，且凍存液需現(xiàn)配現(xiàn)用。
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