嗜冷菌計(jì)數(shù)瓊脂（乳平板計(jì)數(shù)瓊脂）的原理與使用方法！
小楊 / 2026-01-12 09:57:08
嗜冷菌計(jì)數(shù)瓊脂是專(zhuān)門(mén)用于乳制品中嗜冷菌計(jì)數(shù)的選擇性培養(yǎng)基，這類(lèi)菌株可在低溫（7~10℃）下生長(zhǎng)繁殖，分解乳中蛋白質(zhì)和脂肪導(dǎo)致乳品變質(zhì)，該培養(yǎng)基通過(guò)營(yíng)養(yǎng)供給和溫度篩選實(shí)現(xiàn)目標(biāo)菌的定量計(jì)數(shù)。
一、培養(yǎng)基原理
1、核心營(yíng)養(yǎng)成分
培養(yǎng)基以胰蛋白胨、大豆蛋白胨為氮源，提供細(xì)菌生長(zhǎng)所需的氨基酸、多肽；以乳糖為主要碳源，適配乳源微生物的代謝特性；添加磷酸二氫鉀、硫酸鎂維持滲透壓和 pH 穩(wěn)定，瓊脂作為凝固劑形成固體平板。
2、選擇性篩選機(jī)制
嗜冷菌的最適生長(zhǎng)溫度為 10~20℃，在 6.5~7.0℃ 的低溫條件下仍可生長(zhǎng)，而大多數(shù)中溫菌（如
大腸桿菌、
葡萄球菌）在此溫度下生長(zhǎng)受抑制。
該培養(yǎng)基不添加額外抑菌劑，通過(guò)低溫培養(yǎng)條件實(shí)現(xiàn)對(duì)嗜冷菌的選擇性計(jì)數(shù)，菌落生長(zhǎng)后直接統(tǒng)計(jì)平板上的菌落數(shù)（CFU），換算成每克/毫升樣品中的嗜冷菌數(shù)量。
二、使用方法（適用于乳制品檢測(cè)，遵循 GB 4789.18-2010 等標(biāo)準(zhǔn)）
1、培養(yǎng)基制備（干粉劑型，按說(shuō)明書(shū)配比）
操作步驟 實(shí)踐細(xì)節(jié) 質(zhì)量控制要點(diǎn)
稱(chēng)量溶解 取規(guī)定量干粉（如 23.5g/1000mL），加入蒸餾水或去離子水，攪拌均勻 避免干粉結(jié)塊，可加熱助溶
滅菌處理 121℃高壓蒸汽滅菌 15min 滅菌后 pH 應(yīng)為 6.8±0.2，若偏差需用 1mol/L HCl/NaOH 調(diào)整
倒平板 待培養(yǎng)基冷卻至 45~50℃時(shí)，無(wú)菌操作傾注到無(wú)菌培養(yǎng)皿中，每皿 15~20mL，凝固后備用 平板厚度均勻，無(wú)氣泡、無(wú)污染；制備好的平板 4℃避光保存，3 天內(nèi)使用
2、樣品處理（以液態(tài)奶、奶粉為例）
液態(tài)奶：無(wú)菌操作吸取 25mL 樣品，加入 225mL 無(wú)菌生理鹽水或磷酸鹽緩沖液（PBS）中，充分搖勻，制成 1:10 的稀釋液。
奶粉：稱(chēng)取 25g 樣品，加入 225mL 無(wú)菌稀釋液，震蕩溶解，制成 1:10 稀釋液。
梯度稀釋?zhuān)焊鶕?jù)樣品污染程度，將 1:10 稀釋液進(jìn)一步做 10 倍系列稀釋?zhuān)ㄈ?10?²、10?³、10??），選擇 3 個(gè)適宜稀釋度進(jìn)行接種。
3、接種與培養(yǎng)
涂布接種：無(wú)菌操作吸取每個(gè)稀釋度的稀釋液 0.1mL，滴加到嗜冷菌計(jì)數(shù)瓊脂平板中央，用無(wú)菌玻璃刮鏟均勻涂布。
或采用傾注法：吸取 1mL 稀釋液加入無(wú)菌培養(yǎng)皿，再倒入冷卻至 45℃的培養(yǎng)基，搖勻凝固。
陰性對(duì)照：同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照（僅接種無(wú)菌稀釋液），驗(yàn)證培養(yǎng)基和操作過(guò)程是否污染。
低溫培養(yǎng)：將接種后的平板倒置，放入 6.5℃±0.5℃ 的恒溫培養(yǎng)箱中，培養(yǎng) 10 天 ±2h。
注意：培養(yǎng)期間需保持溫度穩(wěn)定，避免溫度波動(dòng)影響嗜冷菌生長(zhǎng)。
4、菌落計(jì)數(shù)與結(jié)果計(jì)算
菌落篩選：選擇菌落數(shù)在 25~250CFU 之間的平板進(jìn)行計(jì)數(shù)，若稀釋度適宜，同一稀釋度的兩個(gè)平行平板菌落數(shù)差值應(yīng)≤10%。
結(jié)果換算
涂布法：嗜冷菌數(shù)（CFU/g 或 mL）= 平板菌落數(shù) × 稀釋倍數(shù) × 10
傾注法：嗜冷菌數(shù)（CFU/g 或 mL）= 平板菌落數(shù) × 稀釋倍數(shù)
報(bào)告規(guī)則：若所有稀釋度平板菌落數(shù)均＜25，以最低稀釋度的菌落數(shù)計(jì)算；若均＞250，以最高稀釋度的菌落數(shù)計(jì)算；若空白對(duì)照出現(xiàn)菌落，實(shí)驗(yàn)無(wú)效，需重新檢測(cè)。
三、注意事項(xiàng)
培養(yǎng)基滅菌時(shí)溫度不可過(guò)高、時(shí)間不可過(guò)長(zhǎng)，否則會(huì)導(dǎo)致?tīng)I(yíng)養(yǎng)成分破壞、pH 下降，影響細(xì)菌生長(zhǎng)。
樣品稀釋和接種過(guò)程需嚴(yán)格無(wú)菌操作，防止雜菌污染，尤其注意低溫操作時(shí)的環(huán)境無(wú)菌性。
培養(yǎng)溫度是關(guān)鍵因素，需使用精度高的低溫培養(yǎng)箱，定期校準(zhǔn)溫度；培養(yǎng)時(shí)間不足會(huì)導(dǎo)致菌落計(jì)數(shù)偏低。
該培養(yǎng)基主要用于乳制品中嗜冷菌計(jì)數(shù)，若用于其他樣品，需驗(yàn)證培養(yǎng)基的適用性。
四、常見(jiàn)問(wèn)題排查
平板無(wú)菌落生長(zhǎng)：可能原因是培養(yǎng)基滅菌過(guò)度、培養(yǎng)溫度偏離、樣品稀釋度過(guò)高；排查方法為檢查培養(yǎng)箱溫度、重做稀釋實(shí)驗(yàn)、驗(yàn)證培養(yǎng)基質(zhì)量。
菌落形態(tài)異常：可能是樣品中含大量產(chǎn)黏液菌株，可適當(dāng)提高稀釋度，或采用涂布法減少菌落蔓延。
平行平板菌落數(shù)差異大：可能是接種時(shí)稀釋液涂布不均、樣品未充分混勻；需優(yōu)化接種操作，確保樣品稀釋液搖勻后再接種。
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