血液增菌培養(yǎng)基使用過(guò)程中保證操作無(wú)菌性的具體實(shí)施方法！
小楊 / 2026-01-16 10:11:28
百歐博偉生物：在
血液增菌培養(yǎng)基的使用中，無(wú)菌性是避免雜菌污染、確保低濃度致病菌準(zhǔn)確檢出的核心前提（臨床血液樣本中目標(biāo)菌濃度常低至 1~10 CFU/mL，少量污染即可導(dǎo)致假陽(yáng)性或掩蓋真實(shí)致病菌）。需從環(huán)境、人員、耗材、操作流程、樣本處理五個(gè)維度建立全鏈條無(wú)菌控制體系，以下是具體實(shí)施方法：
一、環(huán)境無(wú)菌控制（操作場(chǎng)所的“無(wú)菌屏障”）
1、核心操作區(qū)域：生物安全柜（二級(jí)及以上）
使用前準(zhǔn)備：
提前 30 分鐘開(kāi)啟紫外線消毒（波長(zhǎng) 254nm），同時(shí)啟動(dòng)通風(fēng)系統(tǒng)（避免紫外線殘留損傷人體）；消毒后用 75% 酒精擦拭工作臺(tái)面、內(nèi)壁、觀察窗及把手，去除灰塵和潛在污染物。
檢查生物安全柜風(fēng)速（垂直氣流 0.38~0.51 m/s）和負(fù)壓狀態(tài)，確保氣流穩(wěn)定（防止外部空氣進(jìn)入柜內(nèi)）。
使用中規(guī)范：
僅放置必要耗材（培養(yǎng)基、樣本、接種工具），避免物品堆積阻擋氣流；耗材擺放遵循“清潔區(qū)→操作區(qū)→污染區(qū)”的順序（如培養(yǎng)基靠?jī)?nèi)側(cè)，污染的接種環(huán)靠外側(cè)）。
禁止在柜內(nèi)進(jìn)行非無(wú)菌操作（如書(shū)寫(xiě)、整理文件），避免動(dòng)作過(guò)大導(dǎo)致氣流紊亂。
使用后清潔：
用 75% 酒精再次擦拭臺(tái)面及接觸過(guò)的區(qū)域，若有血液、菌液污染，先用含氯消毒劑浸泡的紙巾覆蓋 30 分鐘，再擦拭消毒（殺滅頑固致病菌）。
關(guān)閉通風(fēng)系統(tǒng)前，保持紫外線消毒 15 分鐘，徹底殺滅殘留微生物。
2、輔助環(huán)境：實(shí)驗(yàn)室整體無(wú)菌管理
實(shí)驗(yàn)室地面、墻面、桌面每日用含氯消毒劑擦拭 1 次，每周進(jìn)行 1 次全面熏蒸消毒。
控制實(shí)驗(yàn)室人員流動(dòng)，避免無(wú)關(guān)人員進(jìn)入；操作人員進(jìn)入后需更換專(zhuān)用實(shí)驗(yàn)服、鞋套，禁止佩戴首飾、手表（易殘留污染物）。
培養(yǎng)箱、冰箱等設(shè)備：
恒溫培養(yǎng)箱（需氧/厭氧）每周用 75% 酒精擦拭內(nèi)壁，每月進(jìn)行 1 次無(wú)菌驗(yàn)證（放置空白培養(yǎng)基培養(yǎng) 48 小時(shí)，無(wú)雜菌生長(zhǎng)為合格）。
儲(chǔ)存培養(yǎng)基的冰箱（2~8℃）需定期清理，避免過(guò)期培養(yǎng)基、污染樣本與合格耗材混放；冰箱內(nèi)放置消毒棉片，吸附潛在污染物。
二、人員無(wú)菌控制（操作執(zhí)行者的“無(wú)菌意識(shí)”）
1、個(gè)人防護(hù)裝備（PPE）規(guī)范穿戴
必須穿戴無(wú)菌手套、一次性口罩、防護(hù)帽、防護(hù)服/實(shí)驗(yàn)服（防護(hù)服需覆蓋全身，實(shí)驗(yàn)服需經(jīng)高壓滅菌）。
手套佩戴后需用 75% 酒精噴灑消毒，操作過(guò)程中若手套接觸非無(wú)菌表面（如桌面邊緣、手機(jī)），需立即更換新手套；口罩需覆蓋口鼻，避免呼吸氣流中的微生物污染樣本。
長(zhǎng)發(fā)需盤(pán)入防護(hù)帽內(nèi)，禁止用手觸摸面部、頭發(fā)（手上攜帶的皮膚菌群是主要污染源之一，如凝固酶陰性葡萄球菌）。
2、人員操作前的無(wú)菌準(zhǔn)備
操作前用肥皂或洗手液徹底清洗雙手（遵循“七步洗手法”，每個(gè)步驟不少于 15 秒），再用 75% 酒精擦拭雙手至干燥。
避免在操作前接觸可能污染的物品（如門(mén)把手、水杯）；若操作過(guò)程中需離開(kāi)生物安全柜，返回后需重新消毒雙手和手套。
三、耗材與培養(yǎng)基的無(wú)菌控制（源頭無(wú)菌保障）
1、耗材的無(wú)菌處理與檢查
一次性耗材（注射器、移液管、接種環(huán)、血培養(yǎng)瓶）：
選用正規(guī)廠家生產(chǎn)的無(wú)菌耗材，檢查包裝是否完好（無(wú)破損、無(wú)漏液）、有效期是否在范圍內(nèi)。
打開(kāi)包裝時(shí)，避免用手接觸耗材的無(wú)菌部位（如注射器針頭、移液管尖端、接種環(huán)環(huán)部）；若包裝破損或疑似污染，立即丟棄，不得使用。
重復(fù)使用耗材（接種環(huán)、鑷子、剪刀）：
采用高壓蒸汽滅菌（121℃，103.4 kPa，20 分鐘）或干熱滅菌（160℃，2 小時(shí)），滅菌后存放于無(wú)菌容器中，避免二次污染。
接種環(huán)使用過(guò)程中需“一菌一滅菌”：每次劃線后或更換樣本前，置于酒精燈外焰灼燒至紅熱（確保環(huán)部、柄部上端 1~2cm 均被滅菌），冷卻后再使用（冷卻方法：接觸培養(yǎng)基邊緣無(wú)氣泡，避免高溫燙傷細(xì)菌）。
2、培養(yǎng)基的無(wú)菌驗(yàn)證與儲(chǔ)存
使用前檢查：
液體培養(yǎng)基（血培養(yǎng)瓶）：無(wú)渾濁、無(wú)沉淀、無(wú)溶血，瓶身無(wú)破損，密封完好；若出現(xiàn)渾濁、產(chǎn)氣或顏色異常，直接丟棄。
固體培養(yǎng)基（血液瓊脂平板）：表面平整、無(wú)裂痕、無(wú)雜菌菌落，血液分布均勻；若平板邊緣有污染菌、冷凝水過(guò)多，需廢棄。
無(wú)菌驗(yàn)證：
每批培養(yǎng)基（尤其是自制培養(yǎng)基）需抽取 10% 樣本進(jìn)行無(wú)菌試驗(yàn)：液體培養(yǎng)基 35℃培養(yǎng) 48 小時(shí)，固體培養(yǎng)基 35℃培養(yǎng) 72 小時(shí)，無(wú)雜菌生長(zhǎng)為合格。
商業(yè)化培養(yǎng)基需查看廠家提供的無(wú)菌檢驗(yàn)報(bào)告，確保符合 ISO 11133 等標(biāo)準(zhǔn)。
儲(chǔ)存條件：
培養(yǎng)基儲(chǔ)存于 2~8℃冰箱，避免陽(yáng)光直射（防止?fàn)I養(yǎng)成分分解、抑制劑失效）；液體培養(yǎng)基需直立放置，防止泄漏。
培養(yǎng)基復(fù)溫時(shí)（如固體平板從冰箱取出），需在生物安全柜內(nèi)倒置瀝干冷凝水（避免冷凝水滴落導(dǎo)致菌落擴(kuò)散或污染），復(fù)溫至室溫后再使用。
四、核心操作流程的無(wú)菌控制（關(guān)鍵環(huán)節(jié)的“無(wú)菌閉環(huán)”）
1、樣本采集的無(wú)菌操作（臨床血液樣本為重點(diǎn)）
皮膚消毒（最關(guān)鍵的防污染步驟）：
采用“三步消毒法”：75% 酒精擦拭采血部位（直徑≥5cm）→ 待干 30 秒（確保酒精揮發(fā)，避免殘留抑制細(xì)菌）→ 碘酊或 2% 氯己定涂抹（覆蓋酒精消毒區(qū)域）→ 待干 1 分鐘（碘酊需充分作用）→ 75% 酒精脫碘（避免碘殘留損傷皮膚和抑制細(xì)菌）。
消毒后禁止觸摸采血部位，若不慎接觸，需重新消毒。
采血與接種：
采血針頭刺入靜脈后，先抽取 1~2mL 血液丟棄（避免皮膚表面細(xì)菌污染針頭），再采集目標(biāo)血量（成人 5~10mL，兒童 1~3mL）。
血液樣本直接注入無(wú)菌血培養(yǎng)瓶，接種時(shí)避免針頭接觸瓶身外表面；注入后輕輕顛倒 5~10 次（混勻血液與培養(yǎng)基，激活抗凝劑），避免劇烈振蕩導(dǎo)致血液細(xì)胞破裂。
樣本轉(zhuǎn)運(yùn)：
接種后的血培養(yǎng)瓶需立即用無(wú)菌密封袋包裹，標(biāo)注樣本信息，在 2 小時(shí)內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)（避免長(zhǎng)時(shí)間暴露在室溫導(dǎo)致細(xì)菌死亡或雜菌滋生）；若延遲轉(zhuǎn)運(yùn)，需暫存于 2~8℃冰箱，不超過(guò) 24 小時(shí)。
2、增菌培養(yǎng)與分離純化的無(wú)菌操作
增菌瓶開(kāi)啟與取樣：
陽(yáng)性增菌瓶（肉眼觀察渾濁/產(chǎn)氣或儀器報(bào)警）需在生物安全柜內(nèi)開(kāi)啟，開(kāi)啟前用 75% 酒精擦拭瓶塞及瓶頸，待干后用無(wú)菌剪刀或開(kāi)瓶器打開(kāi)（避免瓶塞碎屑掉入培養(yǎng)基）。
取樣時(shí)使用無(wú)菌移液管或注射器，僅抽取 0.1~0.2mL 增菌液（避免取樣過(guò)多導(dǎo)致交叉污染），取樣后立即蓋緊瓶塞，污染的移液管/注射器放入醫(yī)療廢物容器。
平板劃線與接種：
固體平板開(kāi)蓋時(shí)，僅打開(kāi) 1/3~1/2 瓶口（避免空氣中微生物落入），劃線過(guò)程中接種環(huán)不接觸平板邊緣或瓶壁。
劃線后立即蓋緊平板，倒置培養(yǎng)（防止冷凝水滴落污染菌落）；接種不同樣本的平板需分開(kāi)擺放，標(biāo)注樣本編號(hào)，避免混淆。
培養(yǎng)過(guò)程控制：
需氧培養(yǎng)箱內(nèi)的平板需分層擺放，避免堆疊過(guò)密（影響空氣流通）；厭氧培養(yǎng)箱內(nèi)的平板需放置在無(wú)菌托盤(pán)內(nèi)，避免與箱內(nèi)污染物接觸。
培養(yǎng)結(jié)束后，平板需在生物安全柜內(nèi)觀察和處理，避免直接暴露在實(shí)驗(yàn)室環(huán)境中。
3、后續(xù)鑒定與藥敏試驗(yàn)的無(wú)菌操作
革蘭氏染色、生化試驗(yàn)等操作需在生物安全柜內(nèi)進(jìn)行，使用無(wú)菌載玻片、接種針，避免不同樣本間的交叉污染。
藥敏試驗(yàn)的抗菌藥物紙片需無(wú)菌保存，使用前用無(wú)菌鑷子夾取，避免手部接觸紙片（手上的油脂和微生物會(huì)影響抑菌圈形成）。
實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，所有接觸過(guò)樣本的耗材（載玻片、接種工具、培養(yǎng)基）需分類(lèi)處理：
污染的固體培養(yǎng)基、菌液需經(jīng)高壓蒸汽滅菌（121℃，20 分鐘）后再丟棄。
一次性耗材（如移液管、手套）放入黃色醫(yī)療廢物袋，密封后按醫(yī)療廢物處理規(guī)范轉(zhuǎn)運(yùn)銷(xiāo)毀。
五、無(wú)菌性驗(yàn)證與質(zhì)量控制（過(guò)程監(jiān)督與風(fēng)險(xiǎn)排查）
1、陰性對(duì)照設(shè)置
每次實(shí)驗(yàn)需設(shè)置空白對(duì)照：取 1 支未接種樣本的血培養(yǎng)瓶，與樣本同步培養(yǎng)（相同溫度、環(huán)境），若空白對(duì)照出現(xiàn)渾濁、產(chǎn)氣等陽(yáng)性指征，說(shuō)明操作過(guò)程存在污染，需重新實(shí)驗(yàn)。
平板接種時(shí)，設(shè)置無(wú)菌平板對(duì)照：取 1 塊未接種的固體血液瓊脂平板，與樣本平板同步培養(yǎng)，若對(duì)照平板出現(xiàn)雜菌菌落，說(shuō)明培養(yǎng)基或操作環(huán)境存在污染。
2、定期無(wú)菌監(jiān)測(cè)
人員手衛(wèi)生監(jiān)測(cè)：每月對(duì)操作人員進(jìn)行手衛(wèi)生采樣（用無(wú)菌棉拭子擦拭手指表面，接種至營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板），培養(yǎng)后若菌落數(shù)＞10 CFU /手，需重新培訓(xùn)手衛(wèi)生規(guī)范。
環(huán)境監(jiān)測(cè)：每季度對(duì)生物安全柜、培養(yǎng)箱、實(shí)驗(yàn)室空氣進(jìn)行采樣（空氣沉降法或撞擊法），培養(yǎng)后計(jì)算菌落數(shù)，符合《實(shí)驗(yàn)室生物安全通用要求》（GB 19489）：生物安全柜內(nèi)菌落數(shù)≤5 CFU /平板，實(shí)驗(yàn)室空氣≤100 CFU/m³。
耗材與培養(yǎng)基抽檢：每批一次性耗材、自制培養(yǎng)基需隨機(jī)抽取樣本進(jìn)行無(wú)菌試驗(yàn)，不合格批次立即停用并追溯原因（如滅菌參數(shù)、儲(chǔ)存條件）。
3、污染事件處理流程
若發(fā)現(xiàn)樣本污染（如平板出現(xiàn)多種雜菌、空白對(duì)照陽(yáng)性），需立即停止實(shí)驗(yàn)，排查污染源頭：
回顧操作流程：是否存在皮膚消毒不徹底、耗材包裝破損、生物安全柜消毒不規(guī)范等問(wèn)題。
重新驗(yàn)證：更換新的培養(yǎng)基、耗材，重復(fù)操作，同時(shí)增加空白對(duì)照數(shù)量，確認(rèn)無(wú)菌控制有效后再繼續(xù)實(shí)驗(yàn)。
記錄與追溯：詳細(xì)記錄污染事件的時(shí)間、樣本編號(hào)、操作人員、排查結(jié)果及處理措施，便于后續(xù)分析改進(jìn)。
六、關(guān)鍵禁忌與常見(jiàn)誤區(qū)
1、絕對(duì)禁忌
禁止在非無(wú)菌區(qū)域（如普通桌面）進(jìn)行樣本接種、增菌液取樣等核心操作。
禁止用手直接接觸血培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)的培養(yǎng)基、樣本或無(wú)菌耗材的無(wú)菌部位。
禁止將不同患者/樣本的血培養(yǎng)瓶、平板混放，避免交叉污染。
禁止使用過(guò)期、包裝破損或疑似污染的培養(yǎng)基、耗材。
2、常見(jiàn)誤區(qū)及糾正
誤區(qū) 1：紫外線消毒后立即操作 → 糾正：紫外線消毒后需通風(fēng) 10 分鐘，避免紫外線殘留損傷人體，同時(shí)確保柜內(nèi)空氣流通。
誤區(qū) 2：接種環(huán)灼燒后未冷卻直接使用 → 糾正：灼燒后的接種環(huán)需在培養(yǎng)基邊緣冷卻 3~5 秒（無(wú)氣泡產(chǎn)生），避免高溫殺死目標(biāo)菌。
誤區(qū) 3：血液樣本接種后長(zhǎng)時(shí)間放置室溫 → 糾正：接種后 2 小時(shí)內(nèi)必須放入培養(yǎng)箱，延遲接種需暫存于 2~8℃，避免細(xì)菌死亡或雜菌增殖。
誤區(qū) 4：平板劃線時(shí)重復(fù)劃過(guò)同一區(qū)域 → 糾正：分區(qū)劃線時(shí)，每區(qū)僅從上個(gè)區(qū)域末端交叉劃線 1~2 次，確保單菌落形成，同時(shí)減少污染風(fēng)險(xiǎn)。
總結(jié)
血液增菌培養(yǎng)基使用的無(wú)菌性控制核心是“全鏈條閉環(huán)管理”：以生物安全柜為核心操作區(qū)，通過(guò)規(guī)范人員防護(hù)、嚴(yán)格耗材/培養(yǎng)基無(wú)菌驗(yàn)證、標(biāo)準(zhǔn)化操作流程，結(jié)合陰性對(duì)照和定期監(jiān)測(cè)，最大限度減少雜菌污染。關(guān)鍵在于“細(xì)節(jié)把控”—— 從皮膚消毒的每一步、接種環(huán)的冷卻時(shí)間，到培養(yǎng)基的儲(chǔ)存溫度，均需嚴(yán)格遵循 SOP，才能確保低濃度致病菌的準(zhǔn)確分離與鑒定，為臨床診斷和科研結(jié)果提供可靠保障。
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