結晶紫中性紅膽鹽肉湯的核心原理與使用方法及應用范圍！
小楊 / 2026-01-30 09:55:55
結晶紫中性紅膽鹽肉湯（Violet Red Bile Agar Broth，簡稱 VRBA 肉湯，也常稱膽鹽乳糖肉湯的改良型/選擇性增菌型）是食品微生物檢測中用于大腸菌群選擇性增菌、計數的核心培養(yǎng)基，屬于選擇性和鑒別性液體培養(yǎng)基，國標中常用于食品中大腸菌群的初發(fā)酵、增菌培養(yǎng)，也是平板計數法的預增菌基礎，核心適配 GB 4789.3 等食品微生物檢測標準。
一、核心原理
該培養(yǎng)基通過選擇性抑制雜菌 + 鑒別目標菌的雙重機制實現大腸菌群的篩選，各組分功能協(xié)同作用，具體如下：
1、選擇性組分：膽鹽 + 結晶紫
膽鹽（常用牛膽鹽或豬膽鹽）：抑制革蘭氏陽性菌（如
葡萄球菌、
芽孢桿菌、
乳酸菌等）的生長，僅允許革蘭氏陰性菌繁殖；
結晶紫：作為革蘭氏陽性菌的強效抑制劑，進一步提升選擇性，避免雜菌對大腸菌群檢測的干擾，同時對部分非大腸菌群的革蘭氏陰性菌也有輕度抑制作用。
2、鑒別組分：乳糖 + 中性紅
中性紅：酸堿指示劑，pH 變色范圍 6.8~8.0，酸性條件下（pH<6.8）呈紅色/桃紅色，堿性/中性條件下為無色/淡黃色。大腸菌群發(fā)酵乳糖產酸使培養(yǎng)基 pH 下降，中性紅顯色，是判斷大腸菌群存在的核心依據。
3、營養(yǎng)與滲透壓組分
蛋白胨、酵母膏提供氮源、維生素、生長因子，維持細菌正常代謝；氯化鈉調節(jié)培養(yǎng)基滲透壓，保證細菌生長的理化環(huán)境。
核心判定邏輯：培養(yǎng)基中出現渾濁 + 紅色/桃紅色變色，說明有能發(fā)酵乳糖產酸的革蘭氏陰性菌（大腸菌群）生長；無渾濁、培養(yǎng)基保持原色（淡黃色/無色），則為陰性。
二、培養(yǎng)基配方（國標經典配方，1L）
基礎配方為定量溶解后調 pH 至 7.4±0.1，121℃高壓滅菌 15min，各組分含量如下：
蛋白胨：7.0g
酵母膏：3.0g
乳糖：10.0g
牛膽鹽（或豬膽鹽）：1.5g
氯化鈉：5.0g
結晶紫：0.002g（2mg）
中性紅：0.03g（30mg）
蒸餾水：1000mL
注：結晶紫和中性紅為微量指示劑，需單獨溶解后加入，避免直接混合結塊；膽鹽不可高溫久煮，滅菌時間嚴格控制 15min，防止失效。
三、使用方法（適配食品微生物大腸菌群檢測，GB 4789.3）
（一）前期準備：培養(yǎng)基配制與滅菌
按配方稱取各組分，加入蒸餾水，加熱攪拌至完全溶解（避免煮沸，防止乳糖分解）；
用 1mol/L HCl 或 NaOH 調節(jié) pH 至7.4±0.1（25℃）；
分裝至試管/三角瓶（試管可裝 10mL /支，三角瓶按需分裝），加塞、包扎；
121℃高壓蒸汽滅菌 15min，滅菌后迅速取出，冷卻至 37℃左右備用，培養(yǎng)基冷卻后應無沉淀、無變色，呈淡黃色透明狀。
（二）樣品接種與培養(yǎng)（分液體樣品和固體/半固體樣品，核心為初發(fā)酵試驗）
1、固體/半固體樣品（如肉類、糕點、乳制品、蔬菜等）
稱取25g 樣品，放入無菌均質袋中，加入 225mL 無菌生理鹽水/磷酸鹽緩沖液，用無菌均質器均質 1~2min，制成1:10 的樣品勻液；
用無菌移液管吸取 1mL 1:10 勻液，接種至 10mL VRBA 肉湯試管中（也可根據樣品污染程度，接種 10mL 勻液至 90mL VRBA 肉湯三角瓶中，即十倍稀釋）；
若樣品污染度未知，可做系列稀釋（10?¹、10?²、10?³ 等），各稀釋度分別接種 1mL 至 VRBA 肉湯，避免過度生長導致判斷誤差。
2、液體樣品（如飲用水、飲料、醬油、醋等）
清澈液體：直接用無菌移液管吸取1mL 樣品，接種至 10mL VRBA 肉湯試管中；
渾濁液體：先做 1:10 稀釋后，再接種 1mL 稀釋液，操作同固體樣品。
3、培養(yǎng)條件
將接種后的 VRBA 肉湯試管/三角瓶置于36±1℃ 恒溫培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)24±2h；若培養(yǎng) 24h 無明顯反應，可繼續(xù)培養(yǎng)至 48h（國標以 24h 為主要判定時間，48h 為補充）。
（三）結果觀察與判定（初發(fā)酵結果）
培養(yǎng)結束后，觀察培養(yǎng)基的渾濁度和顏色變化，核心判定標準如下：
培養(yǎng)現象 結果判定 后續(xù)操作
培養(yǎng)基渾濁，且呈紅色/桃紅色（整管或局部） 初發(fā)酵陽性 取陽性培養(yǎng)液，劃線接種至結晶紫中性紅膽鹽平板，進行分離培養(yǎng)和復發(fā)酵試驗，確認大腸菌群
培養(yǎng)基無渾濁，保持淡黃色透明狀 初發(fā)酵陰性 無需后續(xù)操作，判定該稀釋度下無大腸菌群生長
培養(yǎng)基渾濁，但未變色（仍為淡黃色） 初發(fā)酵可疑 繼續(xù)培養(yǎng)至 48h，若仍不變色則判定為陰性；若變色則按陽性處理
關鍵注意點：僅渾濁無紅色，說明有非乳糖發(fā)酵的革蘭氏陰性菌生長，并非大腸菌群，需排除；輕微渾濁但明顯紅色，仍判定為陽性（低濃度大腸菌群生長）。
（四）復發(fā)酵試驗（確認大腸菌群，國標必做）
從 VRBA 平板上挑取3~5 個典型菌落（典型菌落為紅色、圓形、凸起、周圍有紅色暈圈，直徑 2~3mm）；
將典型菌落分別接種至乳糖膽鹽發(fā)酵管中，36±1℃培養(yǎng) 24±2h；
若乳糖膽鹽發(fā)酵管出現產酸（培養(yǎng)基變黃）+ 產氣（杜氏小管有氣泡），則復發(fā)酵陽性，確認該菌落為大腸菌群；按陽性菌落數計算樣品中大腸菌群含量。
四、質量控制（QC，實驗室必備，避免假陽性/假陰性）
1、無菌性檢查
取制備好的 VRBA 肉湯 5~10mL，置于 36±1℃培養(yǎng) 24h，培養(yǎng)基應無渾濁、無菌落生長，否則判定為滅菌不合格，廢棄。
2、陽性對照
接種
大腸埃希氏菌 ATCC 25922（標準菌株）至 VRBA 肉湯，36±1℃培養(yǎng) 24h，應出現渾濁 + 紅色，初發(fā)酵陽性，復發(fā)酵也應產酸產氣，證明培養(yǎng)基功能正常。
3、陰性對照
接種
金黃色葡萄球菌 ATCC 25923（革蘭氏陽性菌）至 VRBA 肉湯，36±1℃培養(yǎng) 24~48h，應無渾濁、無生長，證明選擇性有效；若出現生長，說明膽鹽/結晶紫失效，需重新配制培養(yǎng)基。
4、培養(yǎng)基穩(wěn)定性
配制好的 VRBA 肉湯應在 2~8℃冷藏保存，保質期不超過 7d；冷藏后若出現沉淀、變色、渾濁，不可使用。
五、注意事項
無菌操作：全程在無菌超凈工作臺中進行，避免環(huán)境雜菌污染，尤其是革蘭氏陰性菌，防止假陽性；
膽鹽與結晶紫：膽鹽品牌/批次對選擇性影響大，建議使用國標指定品牌；結晶紫濃度不可過高（超過 2mg/L），否則會抑制大腸菌群本身生長，導致假陰性；
樣品稀釋：樣品勻液制備后應在 30min 內接種，避免細菌死亡；稀釋液需現配現用，無菌驗證合格；
培養(yǎng)溫度：嚴格控制 36±1℃，溫度過高（>38℃）會抑制大腸菌群生長，溫度過低（<35℃）會導致生長緩慢，影響判定；
結果判斷：避免將“培養(yǎng)基輕微泛紅但無渾濁”判定為陽性，該現象可能是指示劑吸附，并非細菌產酸；
安全操作：結晶紫為堿性染料，有輕微刺激性，操作時戴手套；培養(yǎng)基滅菌后冷卻至室溫再接觸，防止燙傷。
六、應用范圍
主要用于食品、食品原料、食品加工環(huán)境樣品中的大腸菌群初發(fā)酵增菌和篩選，是食品微生物安全檢測的基礎方法；也可用于飲用水、化妝品等樣品的大腸菌群初步檢測，但需根據對應國標調整接種量和培養(yǎng)條件。
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