用于腸道菌計數(shù)和腸桿菌科鑒別的腸道菌計數(shù)瓊脂知識解析！
小楊 / 2026-02-02 09:13:10
腸道菌計數(shù)瓊脂是腸桿菌科細菌的選擇性計數(shù)培養(yǎng)基，使用核心遵循無高壓滅菌的配制要求+規(guī)范的無菌接種培養(yǎng)+精準的典型菌落判讀，注意事項圍繞培養(yǎng)基成分穩(wěn)定性、操作無菌性、結(jié)果判讀準確性展開，以下是分模塊的清晰梳理，實操性更強：
一、完整使用方法（含配制、接種、培養(yǎng)、計數(shù)/確證）
（一）培養(yǎng)基制備（關鍵：不高壓，短煮沸）
稱量溶解：取 39.5g VRBDA 干粉，加入 1000mL 蒸餾水，攪拌后加熱煮沸至完全溶解，煮沸時間不超過 2 分鐘，防止膽鹽、結(jié)晶紫失效，失去選擇性抑制作用。
倒平板：待培養(yǎng)基冷卻至50℃左右，無菌操作下傾入無菌平皿，每皿 15-20mL，靜置凝固后備用。
空白質(zhì)控：同時取 1mL 無菌稀釋液傾注平板，同條件培養(yǎng)，作為空白對照，應無菌落生長方為合格。
保存：現(xiàn)配現(xiàn)用最佳；若暫用，4℃冷藏保存 1-2 天，禁止反復凍融、長時間放置。
（二）樣品處理與接種（關鍵：梯度稀釋，無菌操作）
梯度稀釋：根據(jù)樣品污染程度，用無菌生理鹽水/緩沖蛋白胨水制備 10 倍遞增稀釋液，每稀釋一次更換無菌吸管，避免交叉污染。
接種方式：選擇 2-3 個適宜稀釋度，各吸取0.1mL 稀釋液，用無菌玻璃刮鏟均勻涂布于 VRBDA 平板，每個稀釋度做2 個平行平板。
（三）培養(yǎng)（關鍵：溫度/時間精準，有氧倒置）
將接種后的平板倒置，置于36±1℃ 有氧培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)18-24 小時，嚴禁培養(yǎng)時間超過 24 小時（易導致菌落融合、非目標菌過度生長，干擾判讀）。
（四）結(jié)果判讀與計數(shù)（核心：典型菌落界定）
典型菌落標準：紅色、直徑≥0.5mm、菌落周圍有清晰的紅色膽鹽沉淀環(huán)，此為腸桿菌科目標菌落。
計數(shù)規(guī)則：選取菌落數(shù)在 15-150CFU之間的平板，計算同稀釋度 2 個平行平板的菌落平均值，再按稀釋倍數(shù)換算，結(jié)果以CFU/g（固體樣品）/CFU/mL（液體樣品）表示。
確證試驗（可選，提高準確性）：挑取典型/可疑菌落，接種于 BGLB 肉湯管，36±1℃培養(yǎng) 24-48 小時，有氣泡產(chǎn)生即為腸桿菌科陽性，無氣泡則排除。
二、核心注意事項（分模塊，規(guī)避實操常見誤差）
（一）培養(yǎng)基配制與保存注意
全程避免高壓滅菌：膽鹽、結(jié)晶紫為熱敏性選擇性成分，高壓會使其失效，僅可短時間煮沸溶解，且攪拌至完全溶解即可，勿過度加熱。
倒平板溫度控制：溫度過高易燙死后續(xù)接種的細菌，且會導致培養(yǎng)基水分快速蒸發(fā)，菌落生長不良；溫度過低則培養(yǎng)基易提前凝固，出現(xiàn)結(jié)塊、厚薄不均。
現(xiàn)配現(xiàn)用：配制后的平板 4℃冷藏超 2 天，會因膽鹽析出、pH 輕微變化，導致選擇性下降、顯色異常，無典型沉淀環(huán)。
（二）樣品接種操作注意
稀釋液選擇：僅用無菌生理鹽水或緩沖蛋白胨水，不可用蒸餾水（低滲會導致細菌破裂），也不可用含抗生素/其他抑菌成分的稀釋液。
涂布規(guī)范：0.1mL 稀釋液滴加后，立即用無菌刮鏟均勻涂布，避免液體聚集在平板中央，導致菌落密集、難以計數(shù)；刮鏟使用前需無菌冷卻，防止高溫燙死細菌。
無菌操作：全程在超凈工作臺進行，平板開蓋時間盡量短，接種工具需徹底滅菌，防止環(huán)境雜菌污染（尤其是革蘭氏陰性菌，會導致計數(shù)結(jié)果偏高）。
（三）培養(yǎng)與結(jié)果判讀注意
培養(yǎng)條件：必須有氧培養(yǎng)，腸桿菌科為兼性厭氧，但 VRBDA 上有氧條件下菌落生長更旺盛、顯色更清晰；平板倒置可防止冷凝水滴落，沖散菌落、破壞沉淀環(huán)。
菌落判讀邊界：直徑＜0.5mm 的紅色小菌落，無沉淀環(huán)，不納入計數(shù)；非紅色（無色/粉色）菌落，無論是否有沉淀環(huán)，均為非目標菌，排除。
計數(shù)平板選擇：若所有稀釋度平板菌落數(shù)＜15，取最低稀釋度平板計算，標注“＜XX CFU/g/mL”；若所有稀釋度平板菌落數(shù)＞150，取最高稀釋度平板計算，標注“＞XX CFU/g/mL”，并重新做更高倍數(shù)稀釋。
（四）其他通用注意
質(zhì)控菌株定期驗證：每次配制批次的 VRBDA，均需用陽性（
大腸埃希氏菌）、陰性（
金黃色葡萄球菌）標準菌株驗證，確保選擇性和顯色性合格，方可用于樣品檢測。
操作耗材無菌：平皿、吸管、刮鏟等均需徹底滅菌，未滅菌的耗材會引入雜菌，直接影響計數(shù)結(jié)果。
結(jié)果記錄：培養(yǎng)結(jié)束后立即判讀計數(shù)，不可放置室溫久置，否則菌落會繼續(xù)生長，沉淀環(huán)擴散融合，無法準確數(shù)清菌落數(shù)。
北京百歐博偉生物技術(shù)有限公司擁有對菌種、細胞、培養(yǎng)基、配套試劑等產(chǎn)品需求者的極優(yōu)質(zhì)服務，對購買項目的前期資料提供,中期合同保證,后期貨物跟蹤到最終售后的確保項目準確到位，都有相關人士進行維護,確保您在
微生物菌種查詢網(wǎng)中獲得最優(yōu)質(zhì)服務！也正因為此，北京百歐博偉生物技術(shù)有限公司與國內(nèi)外多家研制單位、生物制藥、第三方檢測機構(gòu)和科研院所院校、化工企業(yè)有著良好、長期和穩(wěn)定的合作關系！
下載附件
上一篇：結(jié)晶紫中性紅膽鹽肉湯的核心原理與使用方法及應用范圍！
下一篇：羊原代乳腺上皮細胞分離培養(yǎng)的操作步驟及質(zhì)量控制要點！