羊原代乳腺上皮細胞分離培養(yǎng)的操作步驟及質(zhì)量控制要點！
小楊 / 2026-02-02 09:39:14
羊原代乳腺上皮細胞（PMECs）的分離培養(yǎng)核心難點是減少雜細胞污染、降低細胞損傷、保留泌乳分化潛能，全程注意事項需覆蓋取材、消化、純化、培養(yǎng)、傳代凍存全流程，且每個環(huán)節(jié)的操作細節(jié)直接影響細胞純度和活力，以下是分模塊的實操注意事項，均為實驗室可直接落地的質(zhì)控要點：
一、取材環(huán)節(jié)：源頭把控，減少組織損傷與污染
動物選擇：優(yōu)先選健康泌乳中期/孕晚期羊（乳腺組織增殖活性高、泌乳潛能強），避開乳腺炎、乳房外傷個體；取材前對乳房皮膚徹底碘伏 + 75% 酒精消毒，避免體表微生物污染。
組織處理：無菌條件下快速取乳腺腺泡 - 導管區(qū)組織，立即剔除脂肪、結(jié)締組織、血管和筋膜（這些組織易滋生成纖維細胞，且會消耗培養(yǎng)基營養(yǎng)）；組織取出后迅速放入含雙抗（青霉素 + 鏈霉素，100U/mL）+ 兩性霉素 B（0.25μg/mL）的冰浴 D-Hanks/PBS 中，30min 內(nèi)帶回實驗室處理，避免組織缺氧壞死。
組織切塊：超凈臺內(nèi)用無菌手術(shù)刀將組織切至1mm³ 左右勻漿小塊（塊過大消化不徹底，過小易導致細胞破碎），切塊過程中持續(xù)用冷的雙抗緩沖液漂洗，洗去組織血漬（血紅蛋白會抑制細胞活力）。
二、消化環(huán)節(jié)：溫和消化，平衡“分散細胞”與“減少損傷”
1、酶消化法，最常用
酶液配置：Ⅰ型膠原酶（0.1%–0.2%）+ 透明質(zhì)酸酶（0.05%）用無血清 DMEM/F12 現(xiàn)配現(xiàn)用，37℃水浴預熱；避免酶液濃度過高、反復凍融（酶活性下降，易導致消化不徹底或細胞損傷）。
消化條件：組織塊與酶液按1:3（g:mL）混合，37℃恒溫搖床低速振蕩（80–100r/min）消化 3–4h，期間每 30min 輕搖一次，觀察至組織塊變松散、溶液呈絮狀即可（消化過久會破壞細胞膜，導致細胞活力驟降；消化不足則細胞團難以分散）。
終止與過濾：消化完成后立即加入含 10% FBS 的完全培養(yǎng)基終止酶解（FBS 中的蛋白酶抑制劑可快速失活膠原酶）；依次用 200 目、400 目無菌尼龍網(wǎng)過濾（去除未消化的組織塊和細胞團），避免大顆粒雜質(zhì)影響后續(xù)貼壁。
2、組織塊法，適用于少量取材
組織塊貼壁前需瀝干緩沖液（避免液體浮起組織塊，無法貼壁），均勻鋪于膠原包被的培養(yǎng)瓶底，輕壓使組織塊與瓶底充分接觸。
先倒置培養(yǎng)瓶 37℃、5% CO?培養(yǎng) 2–3h，待組織塊初步貼壁后，再緩慢加入少量培養(yǎng)基（液面剛沒過組織塊即可），避免培養(yǎng)基沖擊導致組織塊脫落。
三、純化環(huán)節(jié)：核心去成纖維細胞，提升上皮細胞純度
成纖維細胞是 PMECs 最主要的雜細胞，需通過多重方法聯(lián)合純化，且純化需在分離后盡早進行：
差速貼壁法：過濾后的細胞懸液接種至未包被的培養(yǎng)瓶，37℃培養(yǎng)1–2h（成纖維細胞貼壁速度遠快于上皮細胞），輕輕吸取上清液，將未貼壁的上皮細胞轉(zhuǎn)移至新的膠原包被培養(yǎng)瓶，此步驟可去除 60% 以上成纖維細胞。
差速消化法：后續(xù)細胞貼壁后，若仍有成纖維細胞，用0.25% 胰酶 + 0.02% EDTA短時間（30s–1min）輕洗瓶底，成纖維細胞會先脫壁，立即吸走消化液，用完全培養(yǎng)基沖洗后繼續(xù)培養(yǎng)（上皮細胞對胰酶消化更耐受）。
培養(yǎng)瓶包被：全程用鼠尾膠原 Ⅰ（5μg/cm²）或多聚賴氨酸包被培養(yǎng)瓶/皿，提升上皮細胞貼壁效率（上皮細胞為貼壁依賴型，成纖維細胞無需包被即可貼壁，此方法可間接篩選上皮細胞）。
四、培養(yǎng)環(huán)節(jié)：精準控溫控環(huán)境，保留細胞表型與潛能
培養(yǎng)基與添加劑：基礎培養(yǎng)基優(yōu)先選DMEM/F12（1:1）（滲透壓適配上皮細胞），添加5%–10% 胎牛血清（FBS，優(yōu)選低內(nèi)毒素批次）+EGF（10ng/mL）+ 胰島素（5μg/mL）+ 氫化可的松（0.1μmol/L）+ITS 混合液；血清濃度不可過高（>10% 會抑制乳腺上皮細胞的泌乳分化潛能），添加劑需現(xiàn)配現(xiàn)加，避免過期。
培養(yǎng)條件：嚴格控制37℃±0.5℃、5%CO?（CO?濃度過低會導致培養(yǎng)基 pH 升高，細胞脫壁；過高則 pH 降低，抑制增殖），培養(yǎng)箱濕度保持 95% 以上，避免培養(yǎng)基蒸發(fā)；培養(yǎng)瓶輕放，前 48h不移動、不換液（上皮細胞貼壁慢，移動易導致貼壁失敗）。
換液時機：首次換液在培養(yǎng) 48–72h進行，吸走上清時輕貼瓶壁操作，避免沖起未完全貼壁的細胞；后續(xù)每 2–3 天換液一次，若培養(yǎng)基出現(xiàn)渾濁、變黃過快，立即換液并排查污染。
雜污染防控：超凈臺操作前紫外消毒 30min，全程戴無菌手套、使用無菌耗材；培養(yǎng)基和試劑均需經(jīng)0.22μm 濾膜抽濾除菌；避免不同細胞株交叉操作，防止支原體/真菌污染（支原體污染會導致細胞增殖緩慢，可定期做支原體 PCR 檢測）。
五、傳代與凍存環(huán)節(jié)：減少細胞應激，保存原始特性
傳代時機與操作：細胞匯合至70%–80%時立即傳代（匯合度過高會出現(xiàn)接觸抑制，且易導致成纖維細胞過度增殖，降低純度）；用胰酶消化時，鏡下觀察至細胞邊緣回縮、變圓即終止（消化過度會破壞細胞間連接和細胞膜，導致傳代后活力低）；傳代比例控制在1:2–1:3（原代上皮細胞增殖慢，不可過度稀釋）。
凍存要點：優(yōu)先凍存P1–P2 代細胞（此代次細胞純度高、泌乳潛能未丟失，P3 代后易出現(xiàn)表型漂移）；凍存液為90%FBS+10%DMSO（現(xiàn)配現(xiàn)用，DMSO 避免反復凍融），細胞密度調(diào)整為1×10?–5×10?個 /mL；采用程序降溫（4℃30min→-20℃1h→-80℃過夜→液氮長期保存），避免溫度驟降導致細胞內(nèi)冰晶形成，損傷細胞器。
復蘇注意事項：液氮中取出凍存管后，37℃水浴快速搖晃（1–2min）至凍存液完全融化，全程避免凍存液反復凍融；融化后立即加入 5 倍體積的完全培養(yǎng)基，離心（800r/min，5min）去除 DMSO（DMSO 高濃度會損傷細胞），沉淀用培養(yǎng)基重懸后接種，復蘇后 24h 內(nèi)不換液。
六、全程通用質(zhì)控：避免細胞功能喪失
代次控制：實驗全程優(yōu)先用P1–P3 代細胞，P4 代后乳腺上皮細胞的泌乳分化潛能會顯著下降，且易發(fā)生形態(tài)改變（由鋪路石樣變?yōu)樗笮?，向成纖維細胞樣轉(zhuǎn)化）。
功能維持：若實驗需要保留泌乳功能，培養(yǎng)時可添加催乳素（PRL，5μg/mL），且降低血清濃度至 5%（高血清會抑制乳蛋白基因表達）；避免頻繁換液和劇烈搖晃培養(yǎng)瓶，減少細胞應激。
細胞活力檢測：分離后立即用臺盼藍染色檢測活力，活力≥85%為合格（活力過低則需重新取材）；培養(yǎng)過程中若發(fā)現(xiàn)細胞貼壁少、漂浮多，及時排查培養(yǎng)基、酶液、培養(yǎng)條件等問題。
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