凝膠膜過濾方法實驗的操作流程與質(zhì)量控制要點及注意事項！
小楊 / 2026-02-03 10:02:47
百歐博偉生物：凝膠膜過濾是基于分子大小和形狀差異的液相層析分離技術(shù)，核心原理是利用多孔凝膠的分子篩效應(yīng)：小分子可進入凝膠顆粒的孔隙中，在柱內(nèi)停留時間長、洗脫體積大；大分子無法進入孔隙，隨流動相快速流出，洗脫體積小，從而實現(xiàn)不同分子量物質(zhì)的分離。該方法溫和、不改變物質(zhì)天然構(gòu)象，廣泛用于蛋白質(zhì)、多糖、核酸等生物大分子的分離、純化、脫鹽和分子量測定。
一、核心材料與試劑
1、洗脫液（流動相）
要求溫和、不與樣品/凝膠反應(yīng)、維持樣品天然結(jié)構(gòu)，常用：
中性緩沖液：PBS（0.01~0.05 mol/L，pH 7.0~7.4）、Tris-HCl（0.05 mol/L，pH 7.5~8.0），適用于蛋白質(zhì)/核酸；
純水/低鹽溶液：適用于多糖脫鹽；
注意：洗脫液需經(jīng)0.22 μm 濾膜過濾并脫氣，避免凝膠柱產(chǎn)生氣泡，影響分離效果。
2、輔助試劑與耗材
層析柱（玻璃/不銹鋼，規(guī)格根據(jù)上樣量選擇：柱高/柱徑比一般為 10:1~30:1，柱高越高分辨率越好）；
恒流泵、紫外檢測器、收集器（層析系統(tǒng)）；
燒杯、玻璃棒、漏斗、濾膜、離心管、移液管等；
平衡液（與洗脫液一致）、樣品緩沖液（與洗脫液一致，避免樣品變性/沉淀）。
二、實驗操作流程（經(jīng)典柱層析法，最常用）
全程遵循無菌、無氣泡、溫和操作原則，防止凝膠破碎和樣品失活，步驟分為凝膠預(yù)處理→裝柱→柱平衡→上樣→洗脫→收集與檢測→柱再生與保存。
1、凝膠預(yù)處理
目的是使凝膠充分溶脹，去除雜質(zhì)、細顆粒，保證柱床均勻。
稱量與溶脹：按層析柱體積（一般凝膠床體積占柱容積的 80%）稱量干凝膠，加入過量洗脫液/純水，室溫或水浴溶脹（葡聚糖凝膠 G-25 室溫溶脹 2~4 h，G-200 需室溫溶脹 24 h 或沸水浴溶脹 1 h，縮短溶脹時間且避免結(jié)塊）；
脫氣：溶脹后的凝膠懸液超聲脫氣 5~10 min，或抽真空脫氣，去除內(nèi)部氣泡；
除雜與過篩：凝膠懸液靜置后，傾去上層浮液（含細顆粒、雜質(zhì)），用洗脫液反復(fù)洗滌 2~3 次，也可通過紗布/尼龍網(wǎng)過篩，去除細顆粒（細顆粒會堵塞柱床，降低流速）。
2、裝柱（關(guān)鍵步驟，直接影響分辨率）
核心是一次性裝柱、柱床均勻、無氣泡、無斷層，分為濕法裝柱（最常用）和干法裝柱（僅適用于少數(shù)凝膠），此處介紹濕法裝柱：
層析柱準(zhǔn)備：將層析柱垂直固定在支架上，柱內(nèi)加入 1/3 體積的洗脫液，打開柱下端出口，使洗脫液緩慢流出，排出柱內(nèi)和出口處的氣泡；
裝柱：將溶脹好的凝膠懸液攪拌均勻，沿柱壁緩慢倒入（避免產(chǎn)生氣泡），倒至凝膠床達到預(yù)定高度（柱高/柱徑比≥10:1）；
沉降與壓實：關(guān)閉柱下端出口，讓凝膠自然沉降 30~60 min，然后打開出口，用洗脫液以低流速（0.5~1 mL/min） 沖洗柱床，使凝膠壓實（壓實后的柱床應(yīng)平整、無斷層、無氣泡）；
檢查柱床：若柱床出現(xiàn)斷層、氣泡，需倒出凝膠重新裝柱。
3、柱平衡
目的是使凝膠柱床的離子強度、pH 與洗脫液一致，保證樣品分離的穩(wěn)定性。
用與洗脫液一致的平衡液以1~2 倍柱床體積（CV） 的量，在恒定流速下沖洗凝膠柱（流速與后續(xù)洗脫一致）；
平衡至柱出口的 pH、電導(dǎo)率與平衡液完全一致（可通過 pH 計、電導(dǎo)率儀檢測），且柱床高度穩(wěn)定（無塌陷、無膨脹）。
4、上樣（核心原則：低體積、高濃度、慢上樣）
上樣體積直接影響分辨率，上樣體積越小，分辨率越高，一般上樣體積為柱床體積的 1%~5%（分析級分離）或 5%~10%（制備級分離）。
樣品預(yù)處理：樣品用樣品緩沖液溶解，經(jīng)0.22 μm 濾膜過濾或 10000 r/min 離心 10 min，去除沉淀和不溶性雜質(zhì)，避免堵塞柱床；樣品濃度控制在 1~5 mg/mL（蛋白質(zhì)），避免濃度過高導(dǎo)致分子間相互作用，影響分離；
上樣操作：
打開柱下端出口，使柱床表面的洗脫液恰好與凝膠表面平齊（切勿干柱，凝膠干縮會導(dǎo)致柱床破裂），關(guān)閉出口；
用移液管沿柱壁緩慢滴加樣品（避免沖散凝膠床表面），樣品加完后，打開出口，使樣品緩慢滲入凝膠柱；
待樣品完全滲入凝膠床后，加入少量洗脫液，沖洗柱壁上的樣品，待洗脫液滲入凝膠床后，再加入足量洗脫液至柱內(nèi)液面高度。
5、洗脫
核心是恒定流速、連續(xù)洗脫，保證分子按分子量大小依次流出。
洗脫條件：洗脫液與平衡液一致，流速恒定（根據(jù)凝膠類型選擇：葡聚糖凝膠 G-25 流速 1~2 mL/min，G-200 流速 0.5~1 mL/min；瓊脂糖凝膠流速可適當(dāng)提高），流速過快會導(dǎo)致分離峰重疊，過慢會增加實驗時間且可能導(dǎo)致樣品擴散；
洗脫方式：采用等度洗脫（單一洗脫液，無需改變 pH 和離子強度），凝膠過濾一般無需梯度洗脫，因分離僅依賴分子篩效應(yīng)；
柱內(nèi)液面：洗脫過程中，柱內(nèi)洗脫液液面需始終高于凝膠床表面2~3 cm，防止干柱。
6、收集與檢測
收集：用自動部分收集器按固定體積（1~5 mL /管） 收集洗脫液，記錄每管的收集序號；
檢測：根據(jù)待分離物質(zhì)的性質(zhì)選擇檢測方法，實時檢測各管洗脫液的目標(biāo)物含量：
蛋白質(zhì)：紫外分光光度法（A280 nm）；
核酸：紫外分光光度法（A260 nm）；
多糖：苯酚 - 硫酸法、蒽酮 - 硫酸法；
小分子雜質(zhì)（如鹽）：電導(dǎo)率儀、硝酸銀法（檢測 Cl?）；
繪制洗脫曲線：以收集管序號（或洗脫體積）為橫坐標(biāo)，檢測吸光度（或濃度） 為縱坐標(biāo)，繪制洗脫曲線，出現(xiàn)的吸收峰即為不同分子量的物質(zhì)，目標(biāo)峰對應(yīng)的洗脫液即為純化的樣品。
7、柱再生與保存
目的是去除柱內(nèi)殘留的樣品和雜質(zhì)，延長凝膠使用壽命，保存后可反復(fù)使用。
（1）柱再生
用2~3 倍柱床體積的洗脫液沖洗凝膠柱，去除柱內(nèi)殘留的樣品；
若柱床有蛋白吸附（凝膠輕微吸附），可用0.5 mol/L NaCl 溶液沖洗，再用洗脫液平衡至中性；
若柱床污染嚴(yán)重，可用70% 乙醇或0.5% 次氯酸鈉溶液沖洗，再用大量洗脫液平衡，恢復(fù)凝膠活性。
（2）凝膠保存
短期保存（1~2 周）：凝膠柱保持濕潤，柱內(nèi)加入洗脫液，密封柱兩端，4℃冷藏，避免反復(fù)凍融；
長期保存（數(shù)月）：將凝膠從柱內(nèi)倒出，用洗脫液洗滌 2~3 次，加入0.02% 疊氮鈉（NaN?） 或70% 乙醇（抑菌劑），懸浮后 4℃冷藏；
干凝膠保存：若需長期保存干凝膠，將凝膠用純水洗滌后，室溫晾干，密封保存于干燥處。
三、特殊操作：脫鹽與小分子去除
凝膠過濾是生物大分子脫鹽的常用方法，選擇葡聚糖凝膠 G-25（分級范圍 1000~5000，蛋白質(zhì)分子無法進入孔隙，鹽分子可進入），操作簡化，核心要點：
上樣體積可適當(dāng)提高（為柱床體積的 20%~30%），提高脫鹽效率；
洗脫液用純水或目標(biāo)緩沖液，流速 1~2 mL/min；
檢測：蛋白質(zhì)在 A280 nm 有吸收峰，鹽分子無吸收峰，收集蛋白質(zhì)峰即可得到脫鹽后的樣品，脫鹽率可達 95% 以上。
四、分子量測定
利用凝膠過濾的洗脫體積與分子量的對數(shù)呈線性關(guān)系，可測定未知生物大分子的分子量：
標(biāo)準(zhǔn)曲線制作：選擇 3~5 種已知分子量的球形蛋白標(biāo)準(zhǔn)品，在相同層析條件下上樣，測定各標(biāo)準(zhǔn)品的洗脫體積（Ve）；
計算相對洗脫體積（Kav）：Kav=(Ve−Vo)/(Vt−Vo)，其中Vo為外水體積（完全排阻的大分子的洗脫體積，如藍色葡聚糖 2000），Vt為柱床總體積；以logMW（分子量的對數(shù)） 為縱坐標(biāo)，Kav 為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；未知樣品測定：在相同條件下測定未知樣品的Ve，計算Kav，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線查得對應(yīng)的 logMW，換算得到分子量。
注意：該方法僅適用于球形蛋白，非球形蛋白的測定結(jié)果會有偏差，需校正。
五、關(guān)鍵質(zhì)量控制與注意事項（QC 要點）
1、實驗前質(zhì)控
凝膠填料：檢查保質(zhì)期，確認(rèn)無潮解、結(jié)塊、污染；
洗脫液/緩沖液：現(xiàn)配現(xiàn)用，過濾脫氣，檢測 pH、電導(dǎo)率是否符合要求；
層析柱：檢查密封性，確保無漏液，出口無堵塞。
2、實驗過程質(zhì)控
柱床質(zhì)量：全程保證柱床垂直、均勻、無氣泡、無斷層、不干柱，否則重新裝柱；
流速控制：洗脫過程中流速恒定，避免忽快忽慢，導(dǎo)致峰形展寬、重疊；
樣品預(yù)處理：必須去除沉淀和細顆粒，防止堵塞柱床；樣品濃度適中，避免分子間相互作用；
溫度控制：一般室溫（20~25℃）操作，對溫度敏感的樣品可在 4℃下進行低溫層析。
3、實驗后質(zhì)控
洗脫曲線：目標(biāo)峰應(yīng)對稱、無拖尾、與雜質(zhì)峰完全分離，若峰形展寬，可能是上樣體積過大、流速過快或柱床不均勻；
樣品活性：檢測純化后樣品的生物活性，確保凝膠過濾過程未導(dǎo)致樣品失活；
凝膠再生：再生后的凝膠柱需重新平衡，檢測柱床流速和分辨率，與新柱一致方可再次使用。
六、應(yīng)用領(lǐng)域
生物大分子純化：蛋白質(zhì)（酶、抗體、重組蛋白）、多糖、核酸（DNA、RNA）、多肽的分離純化，獲得高純度天然活性樣品；
脫鹽與小分子去除：生物大分子溶液脫除無機鹽、有機溶劑、小分子雜質(zhì)；
分子量測定：球形蛋白、多糖等大分子的分子量快速測定（相對誤差 ±5%~±10%）；
樣品濃縮：通過凝膠過濾將稀樣品溶液濃縮（選擇合適凝膠，使樣品分子被排阻，洗脫體積小，濃度提高）；
蛋白復(fù)合物與寡聚體分析：分析蛋白質(zhì)的天然聚集體，因復(fù)合物分子量遠大于單體，可有效分離。
七、技術(shù)優(yōu)缺點
1、優(yōu)點
溫和性：分離條件溫和，不使用有機溶劑、高鹽、強酸強堿，可保持樣品的天然構(gòu)象和生物活性；
通用性：僅依賴分子大小，無需樣品與凝膠的特異性結(jié)合，適用于大多數(shù)生物大分子；
操作簡單：無需復(fù)雜的梯度洗脫系統(tǒng)，等度洗脫即可，實驗重復(fù)性好；
可規(guī)?；簭姆治黾墸ㄎ⒘繕悠罚┑街苽浼墸ù罅繕悠罚赏ㄟ^調(diào)整層析柱規(guī)格實現(xiàn)，適合實驗室和工業(yè)生產(chǎn)。
2、缺點
分辨率有限：僅能分離分子量差異較大（≥2 倍）的物質(zhì)，對分子量相近的物質(zhì)分離效果差；
上樣量?。簽楸ＷC分辨率，上樣體積一般≤5% 柱床體積，制備效率較低；
實驗時間較長：流速較慢，尤其是大孔徑凝膠，分離一次需數(shù)小時甚至數(shù)十小時；
凝膠成本較高：高品質(zhì)凝膠價格昂貴，且部分凝膠機械強度低，易破碎。
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