人脂肪間充質(zhì)干細胞培養(yǎng)Protocol
微生物菌種查詢網(wǎng) / 2015-03-26 12:15:56
人脂肪間充質(zhì)干細胞培養(yǎng)Protocol
復(fù)蘇：
1，將
人脂肪間充質(zhì)干細胞凍存管從液氮中取出，置于37℃水浴中使之迅速融解，取出后拿到超凈臺內(nèi)用75%酒精擦拭凍存管旋口處及外壁，防止污染。
2，將凍存管內(nèi)細胞懸液轉(zhuǎn)移至含3-4 ml 人間充質(zhì)干細胞（hMSC）完全培養(yǎng)液的15 ml離心管內(nèi)，以1000 rpm，離心5 min。
3，離心后將上清液吸除，另加入新鮮的人間充質(zhì)干細胞完全培養(yǎng)液2 ml，吹打懸浮。
4，輕輕吹打，制成單細胞懸液，盡量避免氣泡。
5，按照人脂肪間充質(zhì)干細胞說明書中建議復(fù)蘇培養(yǎng)體系轉(zhuǎn)移至一個T25培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，加入培養(yǎng)液6 ml。
6，放入37℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。
7，復(fù)蘇第二天觀察，如死細胞較多，更換新鮮的人間充質(zhì)干細胞完全培養(yǎng)液，可以使細胞生長的更好。
傳代：
備注1：由于人間充質(zhì)干細胞完全培養(yǎng)液是低血清培養(yǎng)液，需要提前取少量人間充質(zhì)干細胞完全培養(yǎng)液，額外加入10% FBS，作為胰酶消化終止液使用。
備注2：細胞不能太密集，否則容易分化。
1，待細胞長到70%-80%滿時進行傳代（見備注2），一般3-5天，具體視細胞生長情況而定。 ,
2，吸除廢液。
3，用PBS（不含鈣鎂離子）輕輕沖洗一遍。
4，加入1-2 ml的0.05% 胰酶（含EDTA）至培養(yǎng)瓶，輕輕晃動，使胰酶覆蓋底面，置于37℃培養(yǎng)箱內(nèi)消化細胞。
4，在顯微鏡下觀察，直至細胞層全部脫落（一般需要1-2 min）。
5，加2 ml 胰酶消化終止液（即備注1中：額外加入10% FBS的人間充質(zhì)干細胞完全培養(yǎng)液）終止消化。
6，1000 rpm離心5 min，去上清，加入人間充質(zhì)干細胞完全培養(yǎng)液2 ml。 ,
7，多次輕輕吹打細胞，制成單細胞懸液。
8，按照1:2-1:3的比例進行傳代。
9，放入37℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。
凍存：
1，按傳代的方法將細胞消化下來，制成細胞懸液。
2，以1000 rpm，離心5 min，棄上清，逐滴加入已經(jīng)預(yù)冷的凍存液，
懸浮細胞。
3，按每支凍存管內(nèi)加入500 ml細胞懸液分裝到凍存管內(nèi)，標記細胞名稱、代數(shù)、凍存日期等基本信息。
4，將凍存管置于程序降溫盒內(nèi)，-80℃過夜，轉(zhuǎn)入液氮。
凍存液配方：
人間充質(zhì)干細胞完全培養(yǎng)液60%，F(xiàn)BS 30%，DMSO 10%
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