一、背景
人乳腺導(dǎo)管癌細(xì)胞是一種紡錘形的細(xì)胞，1976年由其親本MDA-MB-435細(xì)胞中篩選得到。MDA-MB-435細(xì)胞是從31歲的轉(zhuǎn)移性乳腺導(dǎo)管腺癌女性患者胸水中分離得到。當(dāng)用熒光染料對(duì)微管蛋白進(jìn)行染色時(shí)，親本細(xì)胞顯現(xiàn)散布特征(Ⅱ型)。最近通過cDNA陣列研究表明，親本(MDA-MB-435細(xì)胞)可歸入黑素瘤起源。
二、人乳腺導(dǎo)管癌細(xì)胞培養(yǎng)操作
1）復(fù)蘇人乳腺導(dǎo)管癌細(xì)胞：將含有1mL細(xì)胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加入4mL培養(yǎng)基混合均勻。在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，補(bǔ)加1-2mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細(xì)胞懸液加入培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜（或?qū)⒓?xì)胞懸液加入10cm皿中，加入約8ml培養(yǎng)基，培養(yǎng)過夜）。第二天換液并檢查細(xì)胞密度。
2）人乳腺導(dǎo)管癌細(xì)胞傳代：如果人乳腺導(dǎo)管癌細(xì)胞密度達(dá)80%-90%，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。
1.棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤(rùn)洗細(xì)胞1-2次。
2.加1ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中，置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘，然后在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，若細(xì)胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺(tái)，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加少量培養(yǎng)基終止消化。
3.按6-8ml/瓶補(bǔ)加培養(yǎng)基，輕輕打勻后吸出，在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，補(bǔ)加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻。
4.將人乳腺導(dǎo)管癌細(xì)胞懸液按1：2比例分到新的含8ml培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中。
3）人乳腺導(dǎo)管癌細(xì)胞凍存：待人乳腺導(dǎo)管癌細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好時(shí)，可進(jìn)行細(xì)胞凍存。
下面T25瓶為類；
1、人乳腺導(dǎo)管癌細(xì)胞凍存時(shí)，棄去培養(yǎng)基后，PBS清洗一遍后加入1ml胰酶，細(xì)胞變圓脫落后，加入1ml含血清的培養(yǎng)基終止消化，可使用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)。
2、4 min 1000rpm離心去掉上清。加1ml血清重懸細(xì)胞，根據(jù)細(xì)胞數(shù)量加入血清和DMSO，輕輕混勻，DMSO終濃度為10%，細(xì)胞密度不低于1x106/ml，每支凍存管凍存1ml細(xì)胞懸液，注意凍存管做好標(biāo)識(shí)。
3、將凍存管置于程序降溫盒中，放入-80度冰箱，2個(gè)小時(shí)以后轉(zhuǎn)入液氮灌儲(chǔ)存。記錄凍存管位置以便下次拿取。
三、應(yīng)用
人乳腺導(dǎo)管癌細(xì)胞可以用于B-降膽甾醇衍生物的合成及抗腫瘤活性研究：
參考膽固醇在人體中的生物降解程序,以膽固醇為原料,經(jīng)過臭氧氧化、環(huán)化縮合、還原及氧化反應(yīng),分別得到6個(gè)B-環(huán)斷環(huán)膽固醇和B-環(huán)縮環(huán)膽固醇(B-降膽固醇)及它們的還原產(chǎn)物及氧化產(chǎn)物,然后對(duì)這些膽固醇的降解產(chǎn)物分別進(jìn)行體外抗腫瘤活性篩選研究。
在此研究的基礎(chǔ)上,對(duì)B-降膽固醇的3-位羥基進(jìn)行酯化修飾,形成不同結(jié)構(gòu)的酯基,同時(shí)將6-位醛基氧化成為羧基或者還原成醇,最后合成得到一系列3-酯基-B-降膽甾-6-羧酸和3-酯基-B-降膽甾-6-醇。此部分工作共合成得到28個(gè)化合物,其中包括12個(gè)文獻(xiàn)未見報(bào)道的中間產(chǎn)物和14個(gè)文獻(xiàn)未見報(bào)道的目標(biāo)產(chǎn)物,所有合成物都經(jīng)過了IR、NMR和HRMS的結(jié)構(gòu)表征。
同時(shí),采用卵巢癌細(xì)胞(SKOV3)、人乳腺癌細(xì)胞(MCF-7)、人乳腺導(dǎo)管癌細(xì)胞(T47D)、人肺癌細(xì)胞(H460)和人腎上皮細(xì)胞(HEK293T)作為篩選對(duì)象,對(duì)合成物進(jìn)行了體外抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)增殖活性測(cè)試。
保留對(duì)B-降膽固醇3-位羥基的酯化修飾,但將B-降膽固醇的6-位醛基進(jìn)一步轉(zhuǎn)換成為在前期工作中證實(shí)具有顯著抗腫瘤活性的縮氨硫脲藥效團(tuán),由此得到一系列的3-酯基-B-降膽甾縮氨硫脲化合物。
另外,經(jīng)過類似的合成方法,在獲得B-降膽甾醇母體后,將3-位羥基氧化為羰基,然后6-位醛基轉(zhuǎn)換成為4-甲基硫代縮氨基脲,3-位羰基進(jìn)一步肟化或轉(zhuǎn)換成為其它含N的肟醚官能團(tuán),合成得到5個(gè)具有不同3-取代官能團(tuán)的B-降膽甾-4′-甲基硫代縮氨基脲衍生物。
本部分工作共合成得到25個(gè)化合物,其中包括8個(gè)文獻(xiàn)未見報(bào)道的中間產(chǎn)物和12個(gè)文獻(xiàn)未見報(bào)道的目標(biāo)產(chǎn)物。所有合成物都經(jīng)過了IR、NMR和HRMS的結(jié)構(gòu)表征。同時(shí),采用卵巢癌細(xì)胞(SKOV3)、人乳腺癌細(xì)胞(MCF-7)、人乳腺導(dǎo)管癌細(xì)胞(T47D)和人腎上皮細(xì)胞(HEK293T)作為篩選對(duì)象,對(duì)合成物進(jìn)行了體外抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)增殖活性測(cè)試。
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