一、背景
人十二指腸腺癌細(xì)胞是分離自人十二指腸腺癌組織的上皮細(xì)胞樣貼壁細(xì)胞系，主要用于人十二指腸腺癌的體外研究。
十二指腸腺癌指起源于十二指腸黏膜上皮的癌。多為單發(fā)，可由腺瘤惡變而來。組織學(xué)上可見腺瘤-腺癌轉(zhuǎn)化及腺癌中的殘存腺瘤組織。十二指腸腺癌多發(fā)生于降部乳頭周圍，約占60%，其次為壺腹下段，球部最少見。
二、操作方法
取出25cm2培養(yǎng)瓶，75%酒精擦拭培養(yǎng)瓶，拆下封口膜，放入37℃，5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中靜置3-4小時(shí)以穩(wěn)定細(xì)胞狀態(tài)，然后換用新鮮完全培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)或進(jìn)行傳代。
三、細(xì)胞傳代
1）細(xì)胞生長至覆蓋培養(yǎng)瓶的80%面積時(shí)，棄25cm2培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液，用PBS清洗細(xì)胞一次；
2）添加0.25%胰蛋白酶消化液約1ml至培養(yǎng)瓶中，倒置顯微鏡下觀察，待細(xì)胞回縮變圓后加入完全培養(yǎng)液終止消化，再輕輕吹打細(xì)胞使之脫落，然后將懸液轉(zhuǎn)移至15ml離心管中，1000rpm離心5min；
3）棄上清，沉淀細(xì)胞用12ml完全培養(yǎng)基重懸，然后按1:2比例進(jìn)行分瓶傳代，最后放入37℃，5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；
4）待細(xì)胞完全貼壁后，觀察培養(yǎng)結(jié)果，之后進(jìn)行換液培養(yǎng)或傳代。
四、應(yīng)用
用于蓖麻毒蛋白誘導(dǎo)HuTu-80細(xì)胞凋亡的比較蛋白質(zhì)組學(xué)研究：
通過比較蛋白質(zhì)組學(xué)的研究手段,用蓖麻毒蛋白誘導(dǎo)人十二指腸腺癌細(xì)胞（HuTu-80）,分析全蛋白差異表達(dá)的情況,為蓖麻毒蛋白在HuTu-80細(xì)胞中的作用機(jī)理提供新的試驗(yàn)窗口。
1、首先采用硫酸銨鹽析法,從蓖麻種籽中提粗素,通過Sepharose4B柱親和層析和Sephacryl S-200柱凝膠過濾層析對其進(jìn)行純化,經(jīng)p-巰基乙醇處理,可見A鏈分子量為28KDa,B鏈的分子量為32KDa的蓖麻毒素。SDS-PAGE鑒定純化后的蓖麻毒素達(dá)到了電泳純。測定其濃度后,用獲得的蓖麻毒蛋白對HuTu-80細(xì)胞進(jìn)行ICso試驗(yàn)。結(jié)果表明：細(xì)胞形態(tài)發(fā)生變化,而IC50為200ng/ml。
2、構(gòu)建蓖麻毒蛋白誘導(dǎo)HuTu-80細(xì)胞的凋亡模型,通過MTT排除試驗(yàn)、AO/EB染色、Annexin V-FITC/PI雙染檢測細(xì)胞凋亡,確定蓖麻毒蛋白誘導(dǎo)HuTu-80細(xì)胞早期凋亡時(shí)相,提取細(xì)胞組分蛋白進(jìn)行Western-blot分析,觀察HuTu-80細(xì)胞在凋亡過程中細(xì)胞色素c的遷移情況。
結(jié)果表明：蓖麻毒蛋白對HuTu-80細(xì)胞的增殖和生長有明顯的抑制作用,IC50為200ng/ml,最佳攻毒時(shí)間為8h,同時(shí)HuTu-80細(xì)胞的形態(tài)特征與生物化學(xué)特征也發(fā)生了一系列的變化,細(xì)胞核出現(xiàn)皺縮和破裂的情況,釋放出致密顆粒狀凋亡小體,細(xì)胞膜上的磷脂酰絲氨酸出現(xiàn)外翻,而細(xì)胞色素c隨著蓖麻毒蛋白處理時(shí)間的增加,從線粒體易位到細(xì)胞漿逐漸顯著。
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