一、背景
人子宮頸表皮癌細(xì)胞是J.Sykes于1974年建立的（參考ATCC HTB-33）。有報(bào)告稱MS751細(xì)胞含有人乳頭狀瘤病毒18(HPV-18)序列。后來(lái)發(fā)現(xiàn)MS751細(xì)胞包含HPV-45基因組的一部分，而其中E6/E7區(qū)域表達(dá)呈poly(A)+RNA的形式。
二、人子宮頸表皮癌細(xì)胞特性
1)來(lái)源：宮頸表皮樣癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶
2)形態(tài)：上皮細(xì)胞樣
3)含量：>lxl06個(gè)/mL
4)污染：支原體、細(xì)菌、酵母和真菌檢測(cè)為陰性
5)規(guī)格：T25瓶或者lmL凍存管包裝
三、人子宮頸表皮癌細(xì)胞培養(yǎng)步驟
1)人子宮頸表皮癌培養(yǎng)基及培養(yǎng)凍存條件準(zhǔn)備：
1.準(zhǔn)備MEM培養(yǎng)基(MEM,GIBCO,貨號(hào)41500034，添加NaHC03 1.5g八，丙酮酸鈉O.llg八)，90%;優(yōu)質(zhì)胎牛血清，10%。
2.培養(yǎng)條件：氣相：空氣，95%;二氧化碳，5%。溫度：37攝氏度，培養(yǎng)箱濕度為70%-80%。
3.凍存液：90%完全培養(yǎng)基，10%DMSO,現(xiàn)用現(xiàn)配。液氮儲(chǔ)存。
2)人子宮頸表皮癌細(xì)胞處理：
復(fù)蘇人子宮頸表皮癌細(xì)胞：將含有l(wèi)mL細(xì)胞懸液的凍存管在37°C水浴中迅速搖晃解凍，加入4mL培養(yǎng)基混合均勻。在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，補(bǔ)加l-2mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細(xì)胞懸液加入培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過(guò)夜（或?qū)⒓?xì)胞懸液加入l〇cm皿中，加入約8ml培養(yǎng)基，培養(yǎng)過(guò)夜）。第二天換液并檢查細(xì)胞密度。
人子宮頸表皮癌細(xì)胞傳代：如果細(xì)胞密度達(dá)80%-90%，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。
對(duì)于貼壁細(xì)胞，傳代可參考以下方法：棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤(rùn)洗細(xì)胞1-2次。力口2m丨消化液（0.25%Trypsin-0.53mMEDTA)于培養(yǎng)瓶中，置于37°C培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘，然后在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，若細(xì)胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺(tái)，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加少量培養(yǎng)基終止消化。按6-8ml/瓶補(bǔ)加培養(yǎng)基，輕輕打勻后吸出，在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，補(bǔ)加l-2mL培養(yǎng)液后吹勻。將細(xì)胞懸液按1:2到1:5的比例分到新的含8ml培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中。
3)人子宮頸表皮癌細(xì)胞凍存：待細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好時(shí)，可進(jìn)行細(xì)胞凍存。貼壁細(xì)胞凍存時(shí)，棄去培養(yǎng)基后加入少量胰酶，細(xì)胞變圓脫落后，加入約lml含血清的培養(yǎng)基后加入凍存管中，再添加1〇%DMSO后進(jìn)行凍存。
四、應(yīng)用
人子宮頸表皮癌細(xì)胞可以用于細(xì)胞外分泌蛋白CTHRC1在HPV16/18陽(yáng)性的宮頸組織中的表達(dá)和宮頸癌細(xì)胞中的作用機(jī)制研究：
分析CTHRC1在HPV16/18陽(yáng)性的宮頸組織的表達(dá)和宮頸癌細(xì)胞中的功能以探討CTHRC1在HPV16/18陽(yáng)性宮頸癌發(fā)生發(fā)展中的分子機(jī)制,以期CTHRC1成為一個(gè)新的宮頸癌診斷和預(yù)后評(píng)估的生物標(biāo)志物以及宮頸癌治療的新靶點(diǎn)。
方法：
(1)對(duì)1萬(wàn)名婦女進(jìn)行宮頸HPV分型檢測(cè),確定受檢人群高危型HPV分布的特點(diǎn)及高危因素,分析研究人群中宮頸癌及癌前病變患者的高危型HPV分布特點(diǎn)。
(2)利用RNA干擾技術(shù),基因芯片技術(shù)及生物信息學(xué)分析技術(shù)分析宮頸癌細(xì)胞中顯著受HPV16/18E6/E7調(diào)控的細(xì)胞外分泌蛋白,并進(jìn)一步在宮頸癌數(shù)據(jù)庫(kù)網(wǎng)絡(luò)中進(jìn)行驗(yàn)證。
(3)用RT-PCR法比較HPV16/18陽(yáng)性的宮頸組織和HPV陰性的宮頸組織之間,HPV16/18陽(yáng)性的宮頸炎,CIN和宮頸癌組織之間CTHRC1的表達(dá)差異；用免疫組化法分析CTHRC1在宮頸癌,CIN和正常對(duì)照的差異,分析CTHRC1的表達(dá)與宮頸鱗癌臨床病理特征之間的關(guān)系。
(4)構(gòu)建過(guò)表達(dá)和穩(wěn)轉(zhuǎn)干擾慢病毒載體和純化的CTHRC1蛋白,分別檢測(cè)其對(duì)HPV16/18陽(yáng)性的宮頸癌細(xì)胞的增殖,侵襲,遷移和化療抵抗的影響,利用CTHRC1單克隆抗體檢測(cè)其對(duì)純化蛋白處理宮頸癌細(xì)胞的遷移功能影響。
(5)構(gòu)建熒光素酶基因報(bào)告系統(tǒng),檢測(cè)CTHRC1對(duì)宮頸癌Wnt經(jīng)典通路和非經(jīng)典通路的影響,并利用磷酸化信號(hào)通路芯片檢測(cè)CTHRC1對(duì)Wnt經(jīng)典通路和非經(jīng)典通路下游基因的影響。
(6)用ELISA法檢測(cè)CTHRC1在HPV16/18陽(yáng)性的宮頸癌和癌前病變患者血清中的濃度,分析血清CTHRC1濃度評(píng)估宮頸癌的臨床診斷價(jià)值。
結(jié)果：
(1)1萬(wàn)名婦女中宮頸高危型HPV分布由高到低依次為HPV52、16、58、18和33,其中CIN及宮頸癌患者的HPV類型也主要是HPV16,52和18。
(2)HPV16/18陽(yáng)性的宮頸癌細(xì)胞中顯著受E6/E7的轉(zhuǎn)錄調(diào)控的微環(huán)境相關(guān)的細(xì)胞外分泌蛋白前五位依次是GTF2I,INSL6,BIRC3,PTN,CTHRC1,其中CTHRC1與多種腫瘤的發(fā)展相關(guān),我們進(jìn)一步驗(yàn)證了其與宮頸癌的相關(guān)性,確定其為研究的目的基因。
(3)免疫組化染色的結(jié)果顯示,CTHRC1在宮頸鱗癌和宮頸腺癌組織中的高表達(dá)率分別為50.49%和68.96%,明顯高于正常組織(鱗狀上皮3.33%,腺上皮6.67%)及CIN組織21.0%的高表達(dá)率(P<0.0001,P<0.0001,0.0181)；在宮頸鱗癌組織中,CTHRC1的表達(dá)與腫瘤的臨床分期(p=0.0021)、腫瘤細(xì)胞的級(jí)別(p=0.0186),淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(p=0.0075),淋巴脈管浸潤(rùn)(p=0.0010),腫瘤的直徑(P<0.0001)和宮頸基質(zhì)的浸潤(rùn)深度(p=0.0001)均顯著相關(guān),隨著臨床分期的增加,腫瘤級(jí)別的升高,有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和淋巴脈管的浸潤(rùn),腫瘤直徑>4cm和宮頸基質(zhì)浸潤(rùn)深度>1/2者,CTHRC1的高表達(dá)率顯著增加。
(4)劃痕實(shí)驗(yàn)顯示,與對(duì)照組比較,CTHRC1過(guò)表達(dá)細(xì)胞(HeLa和SiHa)及CTHRC1蛋白直接處理細(xì)胞均能明顯促進(jìn)細(xì)胞遷移,CTHRC1穩(wěn)轉(zhuǎn)干擾細(xì)胞均能明顯抑制細(xì)胞遷移,差異均有顯著性(p值均<0.01)。
空穿和膠穿實(shí)驗(yàn)顯示,CTHRC1過(guò)表達(dá)細(xì)胞穿出transwell小室細(xì)胞數(shù)明顯多于對(duì)照組,差異有顯著性(p值均<0.001),CTHRC1穩(wěn)轉(zhuǎn)干擾細(xì)胞穿出transwell小室數(shù)明顯少于對(duì)照組,差異有顯著性(p值均<0.001)?？沾?shí)驗(yàn)還顯示,CTHRC1蛋白處理后細(xì)胞穿出transwell小室細(xì)胞數(shù)明顯多于對(duì)照組,差異有顯著性(p值均<0.001)。
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