一、背景
小鼠肥大細(xì)胞瘤細(xì)胞源自DBA/2小鼠的肥大細(xì)胞瘤；可吞噬乳膠微球，但不吞噬酵母聚糖或卡介苗，沒(méi)有抗體依賴(lài)的細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用。硫酸右旋糖酐、LPS或PPD不能抑制細(xì)胞生長(zhǎng)；產(chǎn)生溶菌酶；鼠痘病毒陰性。
二、小鼠肥大細(xì)胞瘤細(xì)胞培養(yǎng)操作
1）復(fù)蘇小鼠肥大細(xì)胞瘤細(xì)胞：將含有1mL細(xì)胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加入4mL培養(yǎng)基混合均勻。在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，補(bǔ)加1-2mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細(xì)胞懸液加入培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過(guò)夜（或?qū)⒓?xì)胞懸液加入10cm皿中，加入約8ml培養(yǎng)基，培養(yǎng)過(guò)夜）。第二天換液并檢查細(xì)胞密度。
2）小鼠肥大細(xì)胞瘤細(xì)胞傳代：如果細(xì)胞密度達(dá)80%-90%，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。
1.棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤(rùn)洗細(xì)胞1-2次。
2.加1ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中，置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘，然后在顯微鏡下觀(guān)察細(xì)胞消化情況，若細(xì)胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺(tái)，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加少量培養(yǎng)基終止消化。
3.按6-8ml/瓶補(bǔ)加培養(yǎng)基，輕輕打勻后吸出，在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，補(bǔ)加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻。
4.將細(xì)胞懸液按1：2比例分到新的含8ml培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中。
3）小鼠肥大細(xì)胞瘤細(xì)胞凍存：待細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好時(shí)，可進(jìn)行細(xì)胞凍存。
下面T25瓶為類(lèi)；
1、細(xì)胞凍存時(shí)，棄去培養(yǎng)基后，PBS清洗一遍后加入1ml胰酶，細(xì)胞變圓脫落后，加入1ml含血清的培養(yǎng)基終止消化，可使用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)。
2、4 min 1000rpm離心去掉上清。加1ml血清重懸細(xì)胞，根據(jù)細(xì)胞數(shù)量加入血清和DMSO，輕輕混勻，DMSO終濃度為10%，細(xì)胞密度不低于1x106/ml，每支凍存管凍存1ml細(xì)胞懸液，注意凍存管做好標(biāo)識(shí)。
3、將凍存管置于程序降溫盒中，放入-80度冰箱，2個(gè)小時(shí)以后轉(zhuǎn)入液氮灌儲(chǔ)存。記錄凍存管位置以便下次拿取。
三、應(yīng)用
小鼠肥大細(xì)胞瘤細(xì)胞可以用于小鼠肥大細(xì)胞瘤P815細(xì)胞誘導(dǎo)BALB/c鼠產(chǎn)生特異性抗腫瘤免疫效應(yīng)：
采用小鼠肥大細(xì)胞瘤P815細(xì)胞作為抗原皮下免疫BALB/c小鼠,探討其是否可誘導(dǎo)BALB/c小鼠產(chǎn)生較強(qiáng)的、針對(duì)P815細(xì)胞的特異性免疫應(yīng)答,為腫瘤疫苗設(shè)計(jì)篩查抗原提供基礎(chǔ)。
方法小鼠肥大細(xì)胞瘤P815細(xì)胞經(jīng)尾靜脈注入BALB/c小鼠,實(shí)驗(yàn)按每只小鼠注入細(xì)胞數(shù)分為1×107/只組、5×106/只組、2.5×106/只組、1×106/只組、5×105/只組、1×105/只組和溶劑(RPM 11640培養(yǎng)液)對(duì)照組,每組6只小鼠。觀(guān)察各組小鼠的生存狀態(tài)、體重及肝肺脾(重量、形態(tài)、病理)、血涂片、骨髓涂片、白細(xì)胞及血小板計(jì)數(shù)變化。
皮下注入P815細(xì)胞對(duì)BALB/c小鼠形成肥大細(xì)胞瘤/白血病的影響實(shí)驗(yàn)分為4組,即P815細(xì)胞組、米托蒽醌處理的P815細(xì)胞組、L1210細(xì)胞組、溶劑對(duì)照組,每組6只BALB/c小鼠,分別于雙側(cè)臀部皮下注入P815細(xì)胞懸液(PBS液配制,0.5ml/只,細(xì)胞數(shù)5×106/只)、0.1ug/ml米托蒽醌作用12小時(shí)的P815細(xì)胞懸液(PBS液配制,0.5ml/只,細(xì)胞數(shù)5×106/只)、L1210細(xì)胞懸液(PBS液配制,0.5ml/只,細(xì)胞數(shù)5×106/只)和PBS液0.5ml/只。一周后,4組小鼠均尾靜脈注入P815細(xì)胞懸液1.5×106/只(RPMI1640培養(yǎng)基配制,0.15ml/只)。
觀(guān)察各組小鼠生存時(shí)間、血涂片、體重及肝肺脾變化,評(píng)定各組小鼠形成肥大細(xì)胞瘤/白血病情況(觀(guān)察期限為尾靜脈注入P815細(xì)胞后3個(gè)月)。
皮下注入P815細(xì)胞誘導(dǎo)BALB/c鼠產(chǎn)生特異性抗腫瘤免疫效應(yīng)實(shí)驗(yàn)分為2組。隨機(jī)抽取第二章實(shí)驗(yàn)中尾靜脈注入P815細(xì)胞后未死亡的BALB/c小鼠3只設(shè)為實(shí)驗(yàn)組,新購(gòu)買(mǎi)的3只BALB/c小鼠設(shè)為對(duì)照組。對(duì)照組小鼠雙側(cè)臀部皮下注入0.5mlPBS液一周后,和實(shí)驗(yàn)組小鼠一起,頸椎脫臼法處死。無(wú)菌取脾臟,制備脾細(xì)胞懸液。乳酸脫氫酶(LDH)釋放法檢測(cè)兩組小鼠脾細(xì)胞分別對(duì)P815細(xì)胞、L1210細(xì)胞的殺傷率。觀(guān)察兩組小鼠脾細(xì)胞對(duì)P815細(xì)胞克隆形成的影響。實(shí)驗(yàn)各重復(fù)3次。
各實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示。采用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,各組小鼠體重、肝脾肺重、白細(xì)胞和血小板計(jì)數(shù)采用單向方差分析比較,方差齊時(shí)用LSD法行多重比較,方差不齊時(shí)用校正F值的Welch法檢驗(yàn)及Dunnett T3法行多重比較。各組小鼠生存時(shí)間用Kaplan-Meier法行生存分析。兩組脾細(xì)胞對(duì)P815細(xì)胞、L1210細(xì)胞的殺傷率和克隆影響采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)和兩因素兩水平析因設(shè)計(jì)資料的方差分析進(jìn)行比較。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
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