一、背景
大鼠乳腺上皮細胞采用胰蛋白酶-膠原酶混合消化法結合差速貼壁法，并通過上皮細胞專用培養(yǎng)基培養(yǎng)篩選制備而來。大鼠乳腺上皮細胞經Cytokeratin-18（CK18）或PCK(Pan Cytokeratin)免疫熒光鑒定，純度可達90%以上，細胞活性良好，不含細菌、真菌、支原體、傳染性病毒等。
二、大鼠乳腺上皮細胞培養(yǎng)方法
1、收到大鼠乳腺上皮細胞后，請按照以下方法進行操作：
取出25cm2培養(yǎng)瓶，75%酒精擦拭培養(yǎng)瓶，拆下封口膜，放入37℃，5%CO2細胞培養(yǎng)箱中靜置3-4小時以穩(wěn)定細胞狀態(tài)，然后換用新鮮完全培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)或進行傳代。
2、大鼠乳腺上皮細胞傳代：
1）細胞生長至覆蓋培養(yǎng)瓶的80%面積時，棄25cm2培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液，用PBS清洗細胞一次；
2）添加0.25%胰蛋白酶消化液約1ml至培養(yǎng)瓶中，倒置顯微鏡下觀察，待細胞回縮變圓后加入完全培養(yǎng)液終止消化，再輕輕吹打細胞使之脫落，然后將懸液轉移至15ml離心管中，1000rpm離心5min；
3）棄上清，沉淀細胞用12ml完全培養(yǎng)基重懸，然后按1:2比例進行分瓶傳代，最后放入37℃，5%CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；
4）待細胞完全貼壁后，觀察培養(yǎng)結果，之后進行換液培養(yǎng)或傳代。
3、大鼠乳腺上皮細胞凍存：
1）細胞生長至覆蓋培養(yǎng)瓶的80%面積時，棄25cm2培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液，用PBS清洗細胞一次；
2）添加0.25%胰蛋白酶消化液約1ml至培養(yǎng)瓶中，倒置顯微鏡下觀察，待細胞回縮變圓后加入完全培養(yǎng)液終止消化，輕輕吹打細胞使之脫落，然后將懸液轉移至15ml離心管中，1000rpm離心5min；
3）用適量的凍存液（FBS：DMSO=9：1）重懸細胞，并放置于凍存管中；
4）先將細胞凍存管放置于-20℃1.5h，然后將其移入-80℃過夜，24h后轉入液氮中進行長期保存。使用程序降溫盒可直接放入-80℃。
4、大鼠乳腺上皮細胞復蘇：
1）從液氮中取出細胞凍存管（注意：佩戴防爆管面具），快速將其置入37℃水浴中解凍，直至凍存管中無結晶，然后用75%的酒精擦拭凍存管外壁；
2）將凍存管中的細胞移至含5ml完全培養(yǎng)基的15ml離心管中，1000rpm離心5min；
3）棄上清，沉淀用5ml完全培養(yǎng)基重懸，接種25cm2培養(yǎng)瓶，于37℃，5%CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；
4）第二天，換用新鮮完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。
三、應用
大鼠乳腺上皮細胞可以用于當歸芍藥散加味對乳腺增生模型大鼠乳腺上皮細胞let-7、p-ERK表達的影響研究：
通過動物實驗研究當歸芍藥散加味方對乳腺增生大鼠乳腺上皮細胞p-ERK、let-7基因表達的影響,并對大鼠乳腺組織進行病理學觀察,探討當歸芍藥散加味方對乳腺上皮細胞的轉化、增值分化及凋亡的影響,為中醫(yī)藥從調理肝脾法治療乳腺增生病及防治乳腺癌提供一定的科學依據。
方法：SD雌性未孕健康大鼠72只,體重180-200克,通過自由飲水進食、自然光照,適應環(huán)境1周后,如無異常表現,采用分層隨機法,將72只大鼠隨機分為空白對照組16只,實驗組56只。除空白對照組外,其余各組大鼠采用雌、孕激素聯合造模,一個月后,實驗組大鼠再隨機分為模型1組、模型2組、乳癖消組、當歸芍藥散加味組,每組14只。同時處死模型1組大鼠,并將其第2、3對乳房完整剝離做病理切片,置于高倍顯微鏡下觀察其組織學變化,以確定大鼠乳腺增生病理模型是否成功。
造模成功后,治療組予以當歸芍藥散加味生藥提取液灌服,劑量10ml/kg/天,連續(xù)30天;治療對照組以0.3g/kg乳癖消混懸液灌服,連續(xù)30天;空白組對照組和模型2組分別以生理鹽水灌胃,劑量10ml/kg/天,連續(xù)30天。連續(xù)灌胃一個月后,觀察各組大鼠一般情況,處死全部實驗大鼠并留取大鼠乳腺組織標本,測量大鼠乳頭直徑及高度變化;免疫組化法測定各組實驗動物乳腺上皮細胞let-7基因表達與p-ERK蛋白表達,比較其差異性;對各組實驗動物乳腺病理組織學進行比較分析。
結果：模型組、乳癖消組、當歸芍藥散加味組的大鼠乳頭直徑、高度均大于空白組,差異非常顯著,P<0.01;乳癖消組及當歸芍藥散加味組大鼠乳頭直徑、高度均小于模型組,差異非常顯著,P<0.01;乳癖消組與當歸芍藥散加味組大鼠乳頭直徑、高度無顯著性差異,P>0.05。模型組、乳癖消組、當歸芍藥散加味組的大鼠p-ERK基因表達量均大于空白組,差異非常顯著,P<0.01;乳癖消組及當歸芍藥散加味組大鼠p-ERK基因表達量均小于模型組,差異非常顯著,P<0.01;當歸芍藥散加味組p-ERK基因表達量低于乳癖消組,差異非常顯著,P<0.01;模型組、乳癖消組、當歸芍藥散加味組的大鼠let-7基因表達量均小于空白組,差異非常顯著,P<0.01;乳癖消組及當歸芍藥散加味組大鼠let-7基因表達量均大于模型組,差異非常顯著,P<0.01;當歸芍藥散加味組let-7基因表達量高于乳癖消組,差異非常顯著,P<0.01;
結論：當歸芍藥散加味方可減輕大鼠乳腺增生、腫大狀態(tài),改善局部乳腺組織水腫,達到減輕乳腺增生的作用,同時對乳腺增生上皮細胞有促進let-7基因表達、抑制p-ERK蛋白表達的作用,進而抑制細胞增殖、分化,促進細胞凋亡,改善乳腺組織增生狀態(tài)。其機理可能是當歸芍藥散加味方具有養(yǎng)血疏肝,利濕健脾,活血散結之功效,可調節(jié)機體氣血陰陽的動態(tài)平衡,從而達到治療和改善乳腺增生病的目的。
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