一、背景
大鼠胰腺外分泌腺腫瘤細胞也稱為AR42J。，該細胞源自大鼠胰外分泌性腺腫瘤，由N.W.Jessop于1980年建系。大鼠胰腺外分泌腺腫瘤細胞在腎上腺皮質(zhì)激素刺激下可誘導出外分泌活性，并伴有廣泛的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)重構。
二、大鼠胰腺外分泌腺腫瘤細胞的培養(yǎng)
1、大鼠胰腺外分泌腺腫瘤細胞培養(yǎng)基及培養(yǎng)凍存條件準備：
1）準備F-12K培養(yǎng)基；優(yōu)質(zhì)胎牛血清，20%；雙抗，1%。
2）大鼠胰腺外分泌腺腫瘤細胞培養(yǎng)條件：氣相：空氣，95%；二氧化碳，5%。溫度：37℃，培養(yǎng)箱濕度為70%-80%。
3）大鼠胰腺外分泌腺腫瘤細胞凍存液：90%血清，10%DMSO，現(xiàn)用現(xiàn)配。
2、大鼠胰腺外分泌腺腫瘤細胞處理：
1）凍存細胞的復蘇：
將含有1mL細胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加入到含4-6mL完全培養(yǎng)基的離心管中混合均勻。在1000RPM條件下離心3-5min，棄去上清液，完全培養(yǎng)基重懸細胞。然后將細胞懸液加入含6-8ml完全培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶（或皿）中37℃培養(yǎng)過夜。第二天顯微鏡下觀察細胞生長情況和細胞密度。
2）大鼠胰腺外分泌腺腫瘤細胞傳代：如果細胞密度達80%-90%，即可進行傳代培養(yǎng)。
對于貼壁細胞傳代可以參考以下方法：
1、棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細胞1-2次。
2、加入0.25％（w/v）胰蛋白酶-0.53mMEDTA于培養(yǎng)瓶中（T25瓶1-2mL，T75瓶2-3mL），置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘（難消化的細胞可以適當延長消化時間），然后在顯微鏡下觀察細胞消化情況，若細胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加入3-4ml含10%FBS的培養(yǎng)基來終止消化。
3、輕輕打勻后吸出，在1000RPM條件下離心3-5min，棄去上清液，補加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻。將細胞懸液按1：2的比例分到新T25瓶中，添加6-8ml按照說明書要求配置的新的完全培養(yǎng)基以保持細胞的生長活力，后續(xù)傳代根據(jù)實際情況按1:2~1:5的比例進行。
3）大鼠胰腺外分泌腺腫瘤細胞凍存:收到細胞后建議在培養(yǎng)前3代時凍存一批細胞種子以備后續(xù)實驗使用。
三、應用
大鼠胰腺外分泌腺腫瘤細胞可以用于miR-15b-5p對大鼠的胰腺外分泌細胞AR42J凋亡的影響：
急性胰腺炎(Acute pancreatitis,AP)是一種伴有胰臟腺泡細胞損傷凋亡、胰臟炎癥及強烈的全身炎癥反應的胃腸疾病。細胞凋亡的調(diào)節(jié)在整個生物體生長發(fā)育及疾病發(fā)展方面起著重要作用。mi R-15b-5p在多種疾病中有著調(diào)控細胞凋亡繼而影響疾病發(fā)展的作用。而mi R-15b-5p在急性胰腺炎細胞凋亡中的作用尚未被研究,因此本文旨在探究mi R-15b-5p是否參與對急性胰腺炎細胞凋亡的調(diào)控。
方法：在體外將AR42J細胞培養(yǎng)至對數(shù)生長期,加入濃度100n M的雨蛙素進行AP造模,造模完成后提取mi RNA進行采用q RT-PCR檢測mi R-15b-5p相對表達量。隨后利用轉(zhuǎn)染試劑將mi R-15b-5p mimics、mi R-15b-5p mimics NC、mi R-15b-5p inhibitor、mi R-15b-5p inhibitor NC轉(zhuǎn)染進AR42J細胞中,轉(zhuǎn)染24小時后提取mi RNA采用q RT-PCR檢測mi R-15b-5p的相對表達量。
接著將處于對數(shù)生長期的細胞種于六孔板中,按照上述分組對細胞進行轉(zhuǎn)染,24小時后,每孔細胞中加入雨蛙素處理24小時構建體外急性胰腺炎模型,采用q RT-PCR檢測mi R-15b-5p的相對表達量,同時采用q RT-PCR檢測Caspase-3及Caspase-9的m RNA相對表達水平,提取細胞蛋白采用Western blot測定Caspase-3及Caspase-9蛋白相對表達水平,采用流式細胞術來測定各組細胞的凋亡狀況。
結(jié)果：
(1)在AP模型中,q RT-PCR結(jié)果顯示AP組mi R-15b-5p相對表達量較空白對照組增加(P<0.05)。
(2)轉(zhuǎn)染后mi R-15b-5p在mi R-15b-5p mimics組相對表達水平增高(P<0.05),在mi R-15b-5p inhibitor組中相對表達水平降低(P<0.05),說明轉(zhuǎn)染成功。
(3)使用mi R-15b-5p inhibitor后,細胞凋亡有關基因Caspase-3和Caspase-9的m RNA相對表達水平下降(P<0.05),而在使用mimics之后,m RNA相對表達水平提高(P<0.05)。
(4)Western blot測定表明使用mi R-15b-5p inhibitor后,細胞凋亡有關基因Caspase-3和Caspase-9的蛋白質(zhì)相對表達水平下降(P<0.05),而在使用mimics以后,蛋白質(zhì)的相對表達水平上升(P<0.05)。
(5)流式細胞術測定提示使用mi R-15b-5p inhibitor后,細胞凋發(fā)生率下降(P<0.05),而在使用mimics以后,細胞凋亡發(fā)生率上升(P<0.05)。
結(jié)論：發(fā)生胰腺炎時,mi R-15b-5p表達量相對增高,mi R-15b-5p inhibitor能夠減少由雨蛙素所誘發(fā)的胰腺外分泌細胞凋亡,而在使用mi R-15b-5p mimics以后,增加了細胞凋亡。mi R-15b-5p可能通過活化Caspase-9激活下游Caspase-3,誘發(fā)細胞凋亡。故mi R-15b-5p可能是防治急性胰腺炎有效的潛在靶點。
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