一、背景
人成巨核細(xì)胞白血病細(xì)胞源自一位CML患者成巨核細(xì)胞轉(zhuǎn)換期的骨髓細(xì)胞。細(xì)胞質(zhì)因子VIII和表面球蛋白IIb/IIIa，高碘酸-Schiff(PAS)反應(yīng)，α醋酸萘酯酶和酸性磷酸酶陽性。髓過氧化物酶，α丁酸萘酯酶，氯化醋酸AS-D萘苯酚酯酶和堿性磷酸酶陰性。用單克隆抗體BA-1(抗B細(xì)胞，粒性白細(xì)胞)，HPL-3(抗球蛋白IIb/IIIa)和20.3(抗單核細(xì)胞，血小板)染色成陽性。其他淋巴和骨髓類抗體成陰性。
二、細(xì)胞培養(yǎng)步驟
1、培養(yǎng)基及培養(yǎng)凍存條件準(zhǔn)備：
1）準(zhǔn)備RPMI-1640培養(yǎng)基(RPMI-1640:GIBCO,貨號(hào)31800022,添加NaHCO3 1.5g/L,D-葡萄糖2.5g/L,丙酮酸鈉0.11g/L)，90%；優(yōu)質(zhì)胎牛血清，10%。
2）培養(yǎng)條件：氣相：空氣，95%；二氧化碳，5%。溫度：37攝氏度，培養(yǎng)箱濕度為70%-80%。
3）凍存液：90%完全培養(yǎng)基，10%DMSO，現(xiàn)用現(xiàn)配。液氮儲(chǔ)存。
2、細(xì)胞處理：
1）復(fù)蘇細(xì)胞：將含有1mL細(xì)胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加入4mL培養(yǎng)基混合均勻。在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，補(bǔ)加1-2mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細(xì)胞懸液加入培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜（或?qū)⒓?xì)胞懸液加入10cm皿中，加入約8ml培養(yǎng)基，培養(yǎng)過夜）。第二天換液并檢查細(xì)胞密度。
2）細(xì)胞傳代：如果細(xì)胞密度達(dá)80%-90%，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。
對(duì)于懸浮細(xì)胞，傳代可參考以下方法：
方法一：收集細(xì)胞，1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，補(bǔ)加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻，將細(xì)胞懸液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中。
方法二：可選擇半數(shù)換液方式，棄去半數(shù)培養(yǎng)基后，將剩余細(xì)胞懸起，將細(xì)胞懸液按1：2到1：3的比例分到新的含8ml培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中。
3）細(xì)胞凍存：待細(xì)胞生長狀態(tài)良好時(shí)，可進(jìn)行細(xì)胞凍存。懸浮細(xì)胞凍存時(shí)，應(yīng)將細(xì)胞收集，1000RPM條件下離心4分鐘，少量保存上清液（防止細(xì)胞吸走），加入部分新鮮培養(yǎng)基，加入到凍存管中，在凍存管中加入10%DMSO后進(jìn)行凍存。
三、應(yīng)用
人成巨核細(xì)胞白血病細(xì)胞可以用于自噬紊亂對(duì)巨核細(xì)胞發(fā)育的影響和機(jī)制的研究：
探究自噬紊亂對(duì)巨核細(xì)胞發(fā)育可能造成的影響,影響的具體階段以及發(fā)生機(jī)制。
方法：主要通過利用體外自噬流調(diào)節(jié)藥物雷帕霉素(Rap),巴弗洛霉素(BafA)和體內(nèi)巨核細(xì)胞-血小板上自噬基因Atg7特異性敲除小鼠模型(Atg7flox/flox PF4-Cre)分別造成不同發(fā)育階段的巨核細(xì)胞的自噬紊亂和自噬缺失研究自噬對(duì)巨核細(xì)胞發(fā)育的影響。
1、體外研究：首先在造血干細(xì)胞和成熟的巨核細(xì)胞階段加入雷帕霉素(Rap),巴弗洛霉素(BafA)成功調(diào)節(jié)早期和晚期巨核細(xì)胞內(nèi)自噬的水平,通過western blot檢測(cè)經(jīng)典的自噬小體標(biāo)記物L(fēng)C3-Ⅱ的蛋白表達(dá)予以確認(rèn)。然后,結(jié)合巨核細(xì)胞發(fā)育前、后期不同的特點(diǎn)依次檢測(cè)發(fā)育前期巨核細(xì)胞的細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)成熟,代表分化程度的膜蛋白CD41與CD61的表達(dá),前血小板的形成,血小板的釋放和發(fā)育后期巨核細(xì)胞產(chǎn)生前血小板的能力。
2、體內(nèi)研究：檢測(cè)正常生理情況下Atg7flox/flox PF4-Cre小鼠與其同窩對(duì)照小鼠Atg7flox/flox的血小板數(shù)目,巨核細(xì)胞的成熟,以及在低劑量X射線輻照誘導(dǎo)條件下,小鼠獲得暫時(shí)性血小板減少癥之后的血小板恢復(fù)情況。
3、機(jī)制初步探討：運(yùn)用western blot及Q-PCR的方法檢測(cè)調(diào)控巨核細(xì)胞發(fā)育相關(guān)的分子表達(dá),解釋自噬調(diào)控巨核細(xì)胞發(fā)育的可能機(jī)制。結(jié)果我們?cè)谠蛛x的小鼠胎肝細(xì)胞培養(yǎng)基中加入雷帕霉素(Rap)誘導(dǎo)自噬或巴弗洛霉素(BafA)阻斷自噬,我們發(fā)現(xiàn)與溶劑對(duì)照組(DMSO)相比自噬被調(diào)節(jié)的兩組產(chǎn)生的多倍體巨核細(xì)胞數(shù)量明顯減少(Rap 54.8±0.6%,BafA 50.4±3.8%,Ctrl 71.1±2.0%,P＜0.05),同時(shí)代表巨核系分化的膜蛋白CD41和CD61表達(dá)(Rap1.0±0.1%,BafA 0.7±0.0%,Ctrl 5.2±0.1%,P<0.001)及血小板釋放(Rap 0.4±0.3%,BafA 0.7±0.1%,Ctrl 8.5±0.5%,P<0.05)均顯著性降低即用雷帕霉素(Rap)或巴弗洛霉素(BafA)調(diào)節(jié)造血干細(xì)胞的自噬能抑制巨核細(xì)胞的細(xì)胞核的成熟及巨核系的分化。
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