一、背景
嗜水氣單胞菌PCR試劑盒適用于檢測(cè)的扁桃體、淋巴結(jié)等組織病變部與健康部交界處組織、全血等標(biāo)本中嗜水氣單胞菌DNA，適用于嗜水氣單胞菌感染的輔助診斷。
嗜水氣單胞菌PCR試劑盒采用TaqMan探針?lè)▽?shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)，通過(guò)設(shè)計(jì)一對(duì)嗜水氣單胞菌特異性引物，結(jié)合一條特異性探針，用熒光PCR技術(shù)對(duì)嗜水氣單胞菌的核酸進(jìn)行體外擴(kuò)增檢測(cè)，用于臨床上對(duì)可疑感染者的病原學(xué)診斷。
二、嗜水氣單胞菌PCR試劑盒操作步驟
（一）稀釋標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品（以10E2-10E7拷貝/μL這6個(gè)10倍稀釋度為例）。由于標(biāo)準(zhǔn)品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨(dú)立的區(qū)域進(jìn)行，千萬(wàn)不能污染樣品或本試劑盒的其他成分）。
1、標(biāo)記6個(gè)離心管，分別為7，6，5，4，3，2。
2、用帶芯槍頭分別加入45μL熒光PCR專用模板稀釋液，最好用帶芯槍頭，下同）。
3、在7號(hào)管中加入5μL陽(yáng)性對(duì)照（濃度為1×10E8拷貝/μL，試劑盒提供)，充分震蕩1分鐘，得1×10E7拷貝/μL的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。
4、換槍頭，在6號(hào)管中加入5μL1×10E7拷貝/μL的陽(yáng)性對(duì)照(上步稀釋所得)，充分震蕩1分鐘，得1×10E6拷貝/μL的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。
5、換槍頭，在5號(hào)管中加入5μL1×10E6拷貝/μL的陽(yáng)性對(duì)照(上步稀釋所得)，充分震蕩1分鐘，得1×10E5拷貝/μL的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。
6、重復(fù)上面的操作直到得到6個(gè)稀釋度的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。
（二）樣品DNA的制備
7、用自選方法純化樣品的DNA，本產(chǎn)品跟市場(chǎng)上絕大多數(shù)核酸純化產(chǎn)品兼容。
8、如果有N個(gè)樣品，則需要進(jìn)行N+2個(gè)樣品提取，多出的一個(gè)用作樣品制備陽(yáng)性對(duì)照管、另一個(gè)用作樣品制備陰性對(duì)照管。
（三）設(shè)置qPCR反應(yīng)（20μL體系，在樣品制備室進(jìn)行）
9、如果做定量分析并且只做1次重復(fù)，則標(biāo)記N+9個(gè)PCR管，其中N+2個(gè)用于上步得到的N+2個(gè)樣品，1個(gè)用于PCR陰性對(duì)照（用水做模板），6個(gè)用于標(biāo)準(zhǔn)曲線。如果做定性分析，并且只做1次重復(fù)，則標(biāo)記N+4個(gè)PCR管，其中N+2個(gè)用于上步得到的N+2個(gè)樣品，1個(gè)用于PCR陰性對(duì)照（用水做模板），1個(gè)用于PCR陽(yáng)性對(duì)照（用第一步稀釋得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線系列稀釋液的第4號(hào)做模板）。下面只以定量分析為例描述操作步驟。
10、在標(biāo)記管中按下表加入各成分（本表只列出一次重復(fù)）：
（四）數(shù)據(jù)處理
11、如果把本試劑盒用于定量檢測(cè)，則以陽(yáng)性對(duì)照濃度的log值為橫軸，以Ct值為縱軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。再以待測(cè)樣品的Ct值從標(biāo)準(zhǔn)曲線上推算出樣品DNA濃度的log值，再推算出其濃度。
12、如果把本試劑盒用于定性檢測(cè)，只判斷陽(yáng)性或陰性，則陰性對(duì)照Ct必須大于或等于40。陽(yáng)性對(duì)照必須有熒光對(duì)數(shù)增長(zhǎng)，有典型擴(kuò)增曲線，Ct值應(yīng)該小于或等于30。對(duì)待測(cè)樣品，如果其Ct大于或等于40則為陰性，如果小于或等于35則為陽(yáng)性。如果在35-40之間，則重復(fù)一次。重復(fù)實(shí)驗(yàn)的Ct值如果大于或等于40則為陰性，如果小于40，則為陽(yáng)性。
三、應(yīng)用
嗜水氣單胞菌PCR試劑盒可以用于嗜水氣單胞菌感染后鯉Slc15基因表達(dá)研究：
在鯉(Cyprinus carpio)基因組中鑒定出10個(gè)Slc15基因家族成員,比較基因組學(xué)分析顯示鯉Slc15基因顯著擴(kuò)增,并驗(yàn)證了鯉的第四輪全基因組復(fù)制(4R-WGD)。通過(guò)進(jìn)一步系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系分析,證實(shí)該基因家族在鯉進(jìn)化過(guò)程中具有高度保守性。使用半定量RT-PCR法對(duì)鯉健康組織中的Slc15基因表達(dá)分析,發(fā)現(xiàn)大多數(shù)基因表達(dá)表現(xiàn)出組織特異性。
在負(fù)責(zé)消化吸收的鯉腸道中觀察到Slc15基因具有相對(duì)較高的表達(dá)水平,表明Slc15基因在營(yíng)養(yǎng)轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程中起到關(guān)鍵作用。部分基因拷貝具有相似的表達(dá)模式,如Slc15a1b-1/-2、Slc15a2-1/-2和Slc15a4-1/-2,表明兩個(gè)拷貝基因之間的功能可能沒有發(fā)生大的分化。此外,還觀察到部分拷貝基因之間的表達(dá)出現(xiàn)差異,例如Slc15a1a-1/Slc15a1a-2和Slc15a5-1/Slc15a5-2,這些差異反映基因復(fù)制后,不同拷貝之間的功能出現(xiàn)分化,該發(fā)現(xiàn)為鯉全基因組復(fù)制后基因的功能多樣化提供了證據(jù)。
為了研究嗜水氣單胞菌感染后鯉Slc15基因的蛋白表達(dá)模式,本研究首先制備鯉Slc15a1a、Slc15a1b、Slc15a2-1和Slc15a2-2基因的多克隆抗體,從蛋白質(zhì)水平上探究了上述基因在鯉體內(nèi)免疫應(yīng)答機(jī)制中的變化。在對(duì)Slc15a1兩個(gè)拷貝基因的研究中,采用ELISA法檢測(cè)獲得鼠抗Slc15a1a和Slc15a1b的效價(jià)分別為8.1×105和2.7×105。當(dāng)受到嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila)感染時(shí),鯉Slc15a1a和Slc15a1b的最高蛋白表達(dá)水平與空白對(duì)照組相比,分別增加了3.39和2.85倍,說(shuō)明本實(shí)驗(yàn)制備的多克隆抗體具有較高的親和力和特異性,并表現(xiàn)出較強(qiáng)的免疫原性,能夠及時(shí)誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答。
Slc15a1a在嗜水氣單胞菌感染后3 h和6 h迅速做出高表達(dá)量響應(yīng),在12 h后開始出現(xiàn)表達(dá)水平的下降,但Slc15a1b在3～24 h時(shí)卻一直維持著較穩(wěn)定的高表達(dá)響應(yīng),這說(shuō)明Slc15a1a和Slc15a1b之間具有一定的表達(dá)差異。在感染過(guò)程中,Slc15a1a的表達(dá)量基本高于Slc15a1b。因此Slc15a1a可能是Slc15a1的主效基因,在鯉免疫應(yīng)答過(guò)程中起到更加重要的作用。在對(duì)Slc15a2的研究中,也發(fā)現(xiàn)了相似的結(jié)果。
當(dāng)嗜水氣單胞菌感染后,兩個(gè)拷貝基因之間整體具有相似的表達(dá)趨勢(shì),說(shuō)明二者之間可能具有相似的基因功能。Slc15a2-1雖在3 h時(shí)率先做出低表達(dá)響應(yīng),但與Slc15a2-1相比,Slc15a2-2在0 h至48 h之間顯著高表達(dá),可能是作為該基因拷貝中的主效基因,并且從6 h到24 h時(shí),兩個(gè)拷貝就一直呈現(xiàn)互補(bǔ)的表達(dá)方式,共同表達(dá)量維持在較高水平,在面對(duì)病原侵害時(shí)共同做出有效響應(yīng)。
當(dāng)嗜水氣單胞菌感染鯉后,實(shí)時(shí)熒光定量q RT-PCR結(jié)果顯示:幾乎所有的S lc15基因在感染早期都有表達(dá)增加的趨勢(shì),并在感染后12 h達(dá)到最高表達(dá)水平。在脅迫后的最后兩個(gè)階段,表達(dá)水平呈直線下降趨勢(shì),并在48 h達(dá)到最低表達(dá)水平。在感染早期,Slc15基因可以在炎癥因子的刺激下積極上調(diào)表達(dá)水平,通過(guò)“放大”免疫信號(hào),提高機(jī)體抵抗外來(lái)入侵的防御能力。因此,激活Slc15基因可能是一種治療鯉嗜水氣單胞菌感染病的有效方法。
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