一、背景
兔支氣管上皮細胞采用鏈霉蛋白酶-中性蛋白酶混合消化法結(jié)合差速貼壁法，并通過上皮細胞專用培養(yǎng)基培養(yǎng)篩選制備而來。
兔氣管上皮細胞分離自氣管組織；氣管(Trachea)，呼吸器官的一部分；為后壁略平的圓筒型管狀。上端平第六頸椎下緣，與環(huán)狀軟骨相連；向下至第四、五胸椎體(相當胸骨角平面)交界處，分左、右主支氣管，分叉處稱為氣管杈。
氣管主要由14-16個半環(huán)狀軟骨構(gòu)成，有彈性，軟骨為“C”字形的軟骨環(huán)，缺口向后，各軟骨環(huán)以韌帶連接起來，環(huán)后方缺口處由平滑肌和致密結(jié)締組織連接，保持了持續(xù)張開狀態(tài)。管腔襯以粘膜，表面覆蓋纖毛上皮，粘膜分泌的粘液可粘附吸入空氣中的灰塵顆粒，纖毛不斷向咽部擺動將粘液與灰塵排出，以凈化吸入的氣體。
氣管上皮是氣道與外界環(huán)境接觸的第一道防線，不僅是各種病原體、炎癥介質(zhì)作用的靶細胞，還作為效應(yīng)細胞合成、釋放多種炎性介質(zhì)和細胞因子從而參與氣道炎癥及免疫反應(yīng)。體外培養(yǎng)的原代氣管上皮細胞因與體內(nèi)組織在形態(tài)結(jié)構(gòu)和功能活動上存在很大的相似性，因此，在基礎(chǔ)及臨床研究中極為重要。
二、兔支氣管上皮細胞培養(yǎng)步驟
1、兔支氣管上皮細胞培養(yǎng)基及培養(yǎng)凍存條件準備：
1)準備：DMEM+10%FBS+1%P/S
2)培養(yǎng)條件：氣相：空氣，95%；二氧化碳，5%。溫度：37攝氏度，培養(yǎng)箱濕度為70%-80%。
3)凍存液：50%basal medium+40%FBS+10%DMSO。
2、兔支氣管上皮細胞處理：
1）復(fù)蘇細胞：將含有1mL細胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加入4mL培養(yǎng)基混合均勻。在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，補加1-2mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細胞懸液加入培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜（或?qū)⒓毎麘乙杭尤?50px皿中，加入約8ml培養(yǎng)基，培養(yǎng)過夜）。第二天換液并檢查細胞密度。
2）細胞傳代：如果細胞密度達80%-90%，即可進行傳代培養(yǎng)。
對于貼壁細胞，傳代可參考以下方法：
1.棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細胞1-2次。
2.加2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中，置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘，然后在顯微鏡下觀察細胞消化情況，若細胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加少量培養(yǎng)基終止消化。
3.按6-8ml/瓶補加培養(yǎng)基，輕輕打勻后吸出，在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，補加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻。
4.將細胞懸液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中。
注：第一次傳代推薦傳代比例為1:2，以后傳代比例可根據(jù)客戶需要自己決定。
3）兔支氣管上皮細胞凍存：待細胞生長狀態(tài)良好時，可進行細胞凍存。
三、應(yīng)用
兔支氣管上皮細胞可以用于兔支氣管敗血波氏桿菌的分離鑒定及某些生物學特性研究：
從Bb的分離和鑒定、病例的復(fù)制、菌相免疫學和粘附特性四個方面進行了系統(tǒng)的研究。
結(jié)果如下：
1、兔支氣管敗血波氏桿菌的分離與鑒定：通過對江蘇南京地區(qū)4家實驗兔場和山東淄博1家商品兔場有鼻炎癥狀的患兔鼻腔分泌物進行兔支氣管敗血波氏桿菌的分離鑒定，了解支氣管敗血波氏桿菌在兔群中的感染情況，并對該菌的某些生物學特性進行研究。共采集有明顯鼻炎癥狀的194份患兔鼻腔分泌物，分離出56株支氣管敗血波氏桿菌，分離率為17.87％～39.39％，平均分離率28.86％，結(jié)果顯示支氣管敗血波氏桿菌是引起家兔鼻炎的重要病原菌，分離率較高，該病的發(fā)生與季節(jié)具有一定的相關(guān)性，分離菌具有特定的生長特性、形態(tài)特性、生化反應(yīng)特性和對抗生素的敏感特性。
2、支氣管敗血波氏桿菌人工感染動物模型的建立：對鑒定后的19株支氣管敗血波氏桿菌進行了ICR小鼠毒性比較研究，并以此為基礎(chǔ)進行了分離菌對兔致病性差異研究；用BJL0504菌株(Ⅰ相菌)以不同攻毒途徑對30～40日齡兔進行致病作用比較研究；用凍干保存的3株強毒力菌株以靜脈注射途徑攻毒家兔，根據(jù)致病性篩選毒力穩(wěn)定的菌株作為疫苗候選株。ICR小鼠毒性試驗表明，19株分離菌中11株為超強毒，3株為強毒，3株低毒，2株弱毒，分離菌中BJL0504對小鼠和兔均為高致病性，但BALM0503對小鼠為低致病性，對兔為高致病性，其他分離菌對小鼠和兔的致病性也不完全相同；通過肺內(nèi)和靜脈注射感染的兔死亡率較高，發(fā)病癥狀和剖檢癥狀也比滴鼻感染明顯；凍干保存15個月后BJL0504分離菌對兔依然有較高致病性，其他兩株凍干菌致病性也沒有變化，BJL0504分離菌可以作為疫苗候選株。
3、支氣管敗血波氏桿菌不同相小鼠免疫保護試驗：為了研究不同相的支氣管敗血波氏桿菌的免疫保護情況，首先對分離菌的培養(yǎng)特性與相變特點以及不同相的致病性進行了研究，接著對該菌Ⅰ相菌和Ⅲ相菌進行滅活并免疫ICR小鼠，觀察免疫產(chǎn)生期和攻毒保護效果。試驗表明，Bb-F1～F6代菌動力試驗陽性，F(xiàn)7～F12代菌則為陰性，其余生化試驗結(jié)果F1～F12代菌完全相同；根據(jù)細菌溶血情況確定F1和F9分別為Ⅰ相菌和Ⅲ相菌。小鼠攻毒保護試驗表明，經(jīng)Bb-Ⅰ相菌和Ⅲ相菌滅活苗免疫小鼠后，均能產(chǎn)生完全攻毒保護作用。
4、支氣管敗血波氏桿菌粘附特性研究：用HEP-2細胞(人喉上皮細胞癌細胞系)作為體外模型，比較研究了支氣管敗血波氏桿菌Ⅰ相菌和Ⅲ相菌的體外粘附特性和粘附動力學。結(jié)果表明，強毒力分離菌BJL0504菌株Ⅰ相菌在體外可以粘附HEP-2細胞，而其傳代Ⅲ相菌在體外不能粘附該細胞，與該菌Ⅰ相菌和Ⅲ相菌的致病性具有相關(guān)性。粘附動力學試驗顯示隨著作用時間的延長，Bb-Ⅰ相菌在體外粘附HEP-2細胞的數(shù)目也隨之增加，并在165 min時達到高峰。
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