一、背景
副百日咳波氏桿菌PCR試劑盒是一種用于檢測(cè)特定基因（DNA）片斷的試劑盒。
該試劑盒主要通過(guò)一對(duì)波氏桿菌引物介導(dǎo)，在體外對(duì)特定基因（DNA）片斷進(jìn)行快速酶促擴(kuò)增。經(jīng)過(guò)一定數(shù)量的熱循環(huán)擴(kuò)增后，擴(kuò)增產(chǎn)物中所含特定基因數(shù)是原始模板數(shù)的（1+E）n（0<E<1，擴(kuò)增效率=倍），使得檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物中的特定基因成為可能。
二、副百日咳波氏桿菌PCR試劑盒實(shí)驗(yàn)過(guò)程
（一）副百日咳波氏桿菌PCR試劑盒試劑準(zhǔn)備
1、DNA模板
2、對(duì)應(yīng)目的基因的特異引物（在PCR反應(yīng)中，新合成的DNA是要接在一小段序列上才能繼續(xù)按照模板DNA復(fù)制，而不能從無(wú)到有，憑空合成。這一小段序列就是你所要有設(shè)計(jì)的引物。可以是DNA也可以是RNA，一般20多bp，需要根據(jù)你的模板鏈設(shè)計(jì)。因此，擴(kuò)增不同的基因需要設(shè)計(jì)不同的引物）
3、10×PCR Buffer
4、2mM dNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM
5、Taq酶
（二）副百日咳波氏桿菌PCR試劑盒操作步驟
1、在冰浴中，按以下次序?qū)⒏鞒煞旨尤胍粺o(wú)菌0.5ml離心管中。
10×PCR buffer：5μl；dNTP mixl：4μl；引物1（10pM）：2μl；引物2（10PM）：2μl；Taq酶（2U/μl）：1μl；DNA模板（50ng-1μg/μl）：1μl；加ddH2O至：50μl，視PCR儀有無(wú)熱蓋，不加或添加石蠟油。
2、調(diào)整好反應(yīng)程序。將上述混合液稍加離心，立即置PCR儀上，執(zhí)行擴(kuò)增。一般：在93℃預(yù)變性3-5min，進(jìn)入循環(huán)擴(kuò)增階段：93℃40s→58℃30s→72℃60s，循環(huán)30-35次，最后在72℃保溫7min。
3、結(jié)束反應(yīng)，PCR產(chǎn)物放置于4℃待電泳檢測(cè)或-20℃長(zhǎng)期保存。
4、PCR的電泳檢測(cè)：如在反應(yīng)管中加有石蠟油，需用100μlLuFang進(jìn)行抽提反應(yīng)混合液，以除去石蠟油；否則，直接取5-10μl電泳檢測(cè)。
（三）副百日咳波氏桿菌PCR試劑盒注意事項(xiàng)
1、PCR反應(yīng)應(yīng)該在一個(gè)沒(méi)有DNA污染的干凈環(huán)境中進(jìn)行。zui好設(shè)立一個(gè)專用的PCR實(shí)驗(yàn)室。
2、純化模板所選用的方法對(duì)污染的風(fēng)險(xiǎn)有極大影響。一般而言，只要能夠得到可靠的結(jié)果，純化的方法越簡(jiǎn)單越好。
3、所有試劑都應(yīng)該沒(méi)有核酸和核酸酶的污染。操作過(guò)程中均應(yīng)戴手套。
4、PCR試劑配制應(yīng)使用zui高質(zhì)量的新鮮雙蒸水，采用0.22μm濾膜過(guò)濾除菌或高壓滅菌。
5、試劑都應(yīng)該以大體積配制，試驗(yàn)一下是否滿意，然后分裝成僅夠一次使用的量?jī)?chǔ)存，從而確保實(shí)驗(yàn)與實(shí)驗(yàn)之間的連續(xù)性。
6、試劑或樣品準(zhǔn)備過(guò)程中都要使用一次性滅菌的塑料瓶和管子，玻璃器皿應(yīng)洗滌干凈并高壓滅菌。
7、PCR的樣品應(yīng)在冰浴上化開(kāi)，并且要充分混勻
三、應(yīng)用
副百日咳波氏桿菌PCR試劑盒可以用于犬支氣管敗血波氏桿菌的分離鑒定及fimN基因的克隆、表達(dá)和表達(dá)蛋白免疫原性分析：
犬窩咳是由犬支氣管敗血波氏桿菌(Bordetella bronchiseptica,Bb)犬腺病毒(CAV)、犬瘟熱(CDV)和犬副流感病毒(CPiV)中的一種或幾種病原混合感染引起的。本實(shí)驗(yàn)主要目的是了解犬支氣管敗血波氏桿菌在窩咳犬中的分布,分析比較Bb分離株的生物學(xué)特性,并同時(shí)比較三種病毒在窩咳犬中的檢出。
從南京地區(qū)和北京地區(qū)采集了164份患有窩咳的犬鼻腔拭子進(jìn)行Bb的分離鑒定,經(jīng)培養(yǎng)性狀、形態(tài)學(xué)檢查、生理生化試驗(yàn)、血清學(xué)鑒定及副百日咳波氏桿菌PCR試劑盒鑒定,最終分離到16株Bb,分離率為9.8%,藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示16株細(xì)菌生物學(xué)特性和對(duì)抗生素敏感性基本相同。對(duì)16份Bb陽(yáng)性病料樣品進(jìn)行犬腺病毒、犬瘟熱、犬副流感病毒檢測(cè),結(jié)果表明窩咳犬由Bb引發(fā)的幾率占10%,和三種病毒混合感染的情況者占81%。
對(duì)2006年11月至2008年1月在北京和南京地區(qū)分離的16株犬波氏桿菌和一株兔波氏桿菌參考株的fimN基因進(jìn)行了全長(zhǎng)克隆,用MegAlign(DNAStar)比較分析分離株與GenBank中收錄的犬波氏桿菌參考株(登錄號(hào)AF231910)的fimN核苷酸序列,繪制基因進(jìn)化樹(shù)。結(jié)果表明,16株支氣管敗血波氏桿菌的fimN基因序列同源性與犬波氏桿菌參考株序列的同源性在99%以上,和兔波氏桿菌參考株的序列同源性也在99%以上,表明南京和北京兩地的犬源支氣管敗血波氏桿菌的fimN核苷酸序列基本無(wú)變化。
對(duì)克隆載體pMD18T-fimN進(jìn)行雙酶切,將得到的630bp片段以正確的閱讀框架定向克隆于pET-32a(+)中,構(gòu)建PETBb-fimN重組質(zhì)粒表達(dá)載體,然后將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進(jìn)宿主菌BL21中,在37℃1mM IPTG誘導(dǎo)下該片段獲得良好的表達(dá)。
經(jīng)SDS-PAGE鑒定其表達(dá)的融合蛋白質(zhì)約39.4kDa,與預(yù)期值一致。免疫轉(zhuǎn)印試驗(yàn)顯示,體外表達(dá)的該重組蛋白可被兔支氣管敗血波氏桿菌NK0610株兔抗血清識(shí)別。表達(dá)蛋白純化后免疫實(shí)驗(yàn)兔,通過(guò)瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)測(cè)血清抗體效價(jià),結(jié)果顯示血清的沉淀效價(jià)為1:40,表明該重組蛋白具備天然菌毛蛋白N基因的部分抗原表位,為研制CDV的亞單位疫苗提供了侯選材料。
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