一、背景
小鼠逆轉(zhuǎn)錄病毒包裝株是源于TK-NIH/3T3的逆轉(zhuǎn)錄病毒包裝細(xì)胞。PT67 is a retrovirus packaging cell line derived from TK-NIH/3T3 cells.細(xì)胞產(chǎn)生可結(jié)合長臂猿白血病病毒受體Glvr-1或雙嗜性逆轉(zhuǎn)錄病毒受體Ram-1的復(fù)制缺陷逆轉(zhuǎn)錄病毒載體顆粒。
二、細(xì)胞培養(yǎng)步驟
1、培養(yǎng)基及培養(yǎng)凍存條件準(zhǔn)備：
1）準(zhǔn)備DMEM（推薦iCell-0001）培養(yǎng)基；優(yōu)質(zhì)胎牛血清，10%；雙抗，1%。
2）小鼠逆轉(zhuǎn)錄病毒包裝株培養(yǎng)條件：氣相：空氣，95%；二氧化碳，5%。溫度：37攝氏度，培養(yǎng)箱濕度為70%-80%。
3）小鼠逆轉(zhuǎn)錄病毒包裝株凍存液：90%血清，10%DMSO，現(xiàn)用現(xiàn)配。
2、小鼠逆轉(zhuǎn)錄病毒包裝株細(xì)胞處理：
1）凍存細(xì)胞的復(fù)蘇：
將含有1mL細(xì)胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加入到含4-6mL完全培養(yǎng)基的離心管中混合均勻。在1000RPM條件下離心3-5min，棄去上清液，完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞。然后將細(xì)胞懸液加入含6-8ml完全培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶（或皿）中37℃培養(yǎng)過夜。第二天顯微鏡下觀察細(xì)胞生長情況和細(xì)胞密度。
2）小鼠逆轉(zhuǎn)錄病毒包裝株細(xì)胞傳代：如果細(xì)胞密度達(dá)80%-90%，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。
對于貼壁細(xì)胞傳代可以參考以下方法：
1.棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細(xì)胞1-2次。
2.加入0.25％（w/v）胰蛋白酶-0.53 mM EDTA于培養(yǎng)瓶中（T25瓶1-2mL，T75瓶2-3mL），置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘（難消化的細(xì)胞可以適當(dāng)延長消化時(shí)間），然后在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，若細(xì)胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺(tái)，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加入3-4ml含10%FBS的培養(yǎng)基來終止消化。
3.輕輕打勻后吸出，在1000RPM條件下離心3-5min，棄去上清液，補(bǔ)加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻。將細(xì)胞懸液按1：2的比例分到新T25瓶中，添加6-8ml按照說明書要求配置的新的完全培養(yǎng)基以保持細(xì)胞的生長活力，后續(xù)傳代根據(jù)實(shí)際情況按1:2~1:5的比例進(jìn)行。
3）小鼠逆轉(zhuǎn)錄病毒包裝株細(xì)胞凍存:收到細(xì)胞后建議在培養(yǎng)前3代時(shí)凍存一批細(xì)胞種子以備后續(xù)實(shí)驗(yàn)使用。
1.細(xì)胞凍存時(shí)按照細(xì)胞傳代的過程收集消化好的細(xì)胞到離心管中，可使用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，來決定細(xì)胞的凍存密度。一般細(xì)胞的推薦凍存密度為1×10^6~1×107個(gè)活細(xì)胞/ml.
2.1000rpm離心3-5min，去掉上清。用配制好的細(xì)胞凍存液重懸細(xì)胞，按每1ml凍存液含1×10^6~1×107個(gè)活細(xì)胞/ml分配到一個(gè)凍存管中將細(xì)胞分配到凍存管中，標(biāo)注好名稱、代數(shù)、日期等信息。
3.將要凍存的細(xì)胞置于程序降溫盒中，-80度冰箱中過夜，之后轉(zhuǎn)入液氮容器中儲(chǔ)存。同時(shí)記錄好凍存管在液氮容器中的位置以便后續(xù)查閱和使用。
三、應(yīng)用
小鼠逆轉(zhuǎn)錄病毒包裝株可以用于逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)GW112基因在胃癌SGC-7901細(xì)胞中的表達(dá)研究：
利用熒光定量PCR技術(shù),分析GW112基因在胃癌組織、癌旁組織以及正常胃粘膜組織中的表達(dá)差異。其次,利用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pLEGFP-N1系統(tǒng),構(gòu)建人GW112基因增強(qiáng)型表達(dá)載體pLEGFP-N1-GW112,并將其包轉(zhuǎn)出逆轉(zhuǎn)錄病毒,構(gòu)建GW112基因在胃癌細(xì)胞穩(wěn)定過表達(dá)的細(xì)胞模型,為深入了解GW112在胃癌中的作用及抗凋亡機(jī)制,奠定基礎(chǔ)。
本課題實(shí)驗(yàn)內(nèi)容與結(jié)果包括以下幾個(gè)方面：
1、分析比較GW112基因在胃癌組織、癌旁組織以及正常胃粘膜組織中的表達(dá)差異。收集23例胃癌組織、癌旁組織以及正常胃粘膜組織,抽提總RNA,設(shè)計(jì)合成GW112與β-actin的特異引物,利用實(shí)時(shí)定量PCR分析三者間GW112基因的表達(dá)差異。結(jié)果顯示:與癌旁組織以及正常胃粘膜組織相比,GW112基因在胃癌組織明顯上調(diào)(3-6倍);而癌旁組織以及正常胃粘膜組織相比無較大差異(1.3倍);研究顯示GW112基因在胃癌組織屬過表達(dá),與國外研究基本一致。
2、建立GW112穩(wěn)定過表達(dá)的SGC-7901細(xì)胞模型。構(gòu)建pLEGFP-N1-GW112重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體,轉(zhuǎn)染小鼠逆轉(zhuǎn)錄病毒包裝株P(guān)T67包裝細(xì)胞進(jìn)行病毒包裝。經(jīng)G418篩選,建立穩(wěn)定的產(chǎn)毒的小鼠逆轉(zhuǎn)錄病毒包裝株P(guān)T67-GFP與小鼠逆轉(zhuǎn)錄病毒包裝株P(guān)T67-GW112細(xì)胞。
收集病毒經(jīng)純化感染SGC-7901細(xì)胞,再次經(jīng)過G418篩選穩(wěn)定篩選,建立起SGC-7901-GFP對照細(xì)胞以及GW112穩(wěn)定過表達(dá)的SGC-7901-GW112細(xì)胞株。實(shí)時(shí)定量PCR用于分析GW112基因的表達(dá)。
1)PCR擴(kuò)增攜帶信號(hào)肽序列的GW112基因,擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)限制酶消化克隆入逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pLEGFP-N1的SalI與BamHI位點(diǎn)間,構(gòu)建pLEGFP-N1-GW112重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。酶切與測序結(jié)果分析顯示重組質(zhì)粒構(gòu)建正確,且GW112基因與基因庫中NM.006418序列一致。
2)pLEGFP-N1-GW112與pLEGFP-N1對照經(jīng)脂質(zhì)體Lipofectamine 2000.轉(zhuǎn)染如PT67包裝細(xì)胞,經(jīng)G418篩選,獲得穩(wěn)定產(chǎn)毒株P(guān)T67-GFP及PT67-GW112。
3)裂解后產(chǎn)生的病毒感染SGC-7901細(xì)胞,再次經(jīng)G418篩選,獲得了SGC-7901-GFP與SGC-7901-GW112的穩(wěn)定克隆。實(shí)時(shí)定量PCR檢測穩(wěn)定克隆間GW112基因表達(dá)水平。結(jié)果顯示:逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的GW112基因能穩(wěn)定而持久的增強(qiáng)GW112基因在胃癌SGC-7901細(xì)胞中的表達(dá)。
研究GW112基因在胃癌細(xì)胞中功能的前期工作。通過構(gòu)建穩(wěn)定高表達(dá)GW112的人胃癌細(xì)胞SGC7901細(xì)胞株,對進(jìn)一步研究GW112基因表達(dá)對胃癌細(xì)胞的生物學(xué)行為及表型的影響,探索其分子機(jī)制,為侵襲性胃癌的早期診斷及治療奠定良好的基礎(chǔ)。
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