一、背景
人原位胰腺腺癌細(xì)胞是一種人類胰腺腺癌細(xì)胞系，是由一名50歲的男性患者的原位胰腺腺癌組織分離得到的。該細(xì)胞系于1975年由美國(guó)國(guó)立癌癥研究所（NCI）的J. Fogh等人建立。
二、人原位胰腺腺癌細(xì)胞系的培養(yǎng)方法步驟
1、人原位胰腺腺癌細(xì)胞培養(yǎng)基配制
人原位胰腺腺癌細(xì)胞的培養(yǎng)基需要配制和準(zhǔn)備好。常用的培養(yǎng)基包括DMEM（Dulbecco's Modified Eagle's Medium）和RPMI（Roswell Park Memorial Institute）1640培養(yǎng)基。在培養(yǎng)基中加入10%的胎牛血清（FBS）和1%的青霉素/鏈霉素（penicillin/streptomycin）混合抗生素，混合均勻后可以用于培養(yǎng)人原位胰腺腺癌細(xì)胞。
2、人原位胰腺腺癌細(xì)胞的解凍
人原位胰腺腺癌細(xì)胞可以從冷凍存儲(chǔ)的細(xì)胞庫(kù)中解凍。將凍存管放在37℃的水浴中，快速將管子中的細(xì)胞解凍。添加預(yù)先配置好的培養(yǎng)基到細(xì)胞中，輕輕混合細(xì)胞和培養(yǎng)基，將混合物轉(zhuǎn)移至預(yù)先消毒的離心管中。將細(xì)胞離心10分鐘，去除上清液，再次加入預(yù)先配置好的培養(yǎng)基，將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至預(yù)先消毒的培養(yǎng)皿中。
3、人原位胰腺腺癌細(xì)胞的培養(yǎng)
將培養(yǎng)皿放置在37℃的恒溫培養(yǎng)箱中，保持5%的CO2氣氛和適當(dāng)?shù)臐穸?。每?-2天更換一次新的培養(yǎng)基，以促進(jìn)細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖。注意不要在細(xì)胞培養(yǎng)期間將細(xì)胞暴露在空氣中，以防細(xì)胞受到氧化損傷。
4、人原位胰腺腺癌細(xì)胞的傳代
當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到80-90%時(shí)，需要進(jìn)行細(xì)胞的傳代。將培養(yǎng)皿中的細(xì)胞用1X PBS洗滌一次，加入0.25%的胰蛋白酶（trypsin）溶液，將細(xì)胞在37℃的恒溫箱中消化5-10分鐘，將胰蛋白酶溶液去除，加入新的培養(yǎng)基，輕輕混合細(xì)胞和培養(yǎng)基，將混合物轉(zhuǎn)移至新的培養(yǎng)皿中。注意在傳代時(shí)不要過(guò)度消化細(xì)胞，以免影響細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖。
5、人原位胰腺腺癌細(xì)胞的凍存
在細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖期間，需要定期將細(xì)胞進(jìn)行凍存。將人原位胰腺腺癌細(xì)胞中的培養(yǎng)基去除，加入10%的DMSO（dimethyl sulfoxide）和90%的FBS混合液，緩慢混合細(xì)胞和混合液，將混合物轉(zhuǎn)移至預(yù)先消毒的凍存管中。將凍存管放置在-80℃的冰箱中，長(zhǎng)期保存。
三、應(yīng)用
人原位胰腺腺癌細(xì)胞可以用于Toll樣受體7激活對(duì)胰腺癌細(xì)胞株（BxPC-3）增殖、遷移與凋亡的影響及機(jī)制研究：
tlr7的激活對(duì)胰腺癌細(xì)胞株(bxpc-3)增殖、遷移與凋亡的影響及其機(jī)制研究。
方法：培養(yǎng)人原位胰腺腺癌bxpc-3細(xì)胞,通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量(real-time)pcr和westernblot分析,檢測(cè)tlr7受體在mrna和蛋白水平上的表達(dá)。以不同劑量(0μg/ml、1.5μg/ml、3.0μg/ml、5.0μg/ml)的tlr7配體gardiquimod經(jīng)不同的時(shí)間(1d、2d、3d、4d、5d)體外刺激bxpc-3細(xì)胞,mts及流式細(xì)胞術(shù)分析tlr7的激活對(duì)bxpc-3細(xì)胞增殖的影響。tlr7配體gardiquimod(3μg/ml)處理bxpc-3細(xì)胞(1-6d),劃痕實(shí)驗(yàn)方法分析,檢測(cè)其對(duì)bxpc-3細(xì)胞的遷移影響。
tlr7配體gardiquimod(3μg/ml)經(jīng)不同的時(shí)間(1-5d),體外刺激bxpc-3細(xì)胞,流式細(xì)胞術(shù)分析其對(duì)bxpc-3細(xì)胞的凋亡影響。培養(yǎng)bxpc-3細(xì)胞,tlr7配體gardiquimod(3μg/ml)經(jīng)不同的時(shí)間(0min、12min、30min、1h、3h、6h、12h、24h、48h),體外刺激bxpc-3細(xì)胞,作用12h后,通過(guò)westernblot的方法分析,從而探討細(xì)胞周期蛋白cyclinb1、cycline、bcl-2及bax在gardiquimod對(duì)人胰腺癌BxPC-3細(xì)胞增殖、遷移及凋亡調(diào)控中的作用。
結(jié)果：Real-time PCR和Western blot分析證實(shí),在人原位胰腺腺癌BxPC-3細(xì)胞中,mRNA及蛋白水平檢查到TLR7表達(dá),TLR7受體表達(dá)量低于人外周血單核細(xì)胞,表達(dá)相差20.12±7.254倍,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。MTS、流式細(xì)胞術(shù)及劃痕試驗(yàn)分析結(jié)果顯示:TLR7配體Gardiquimod抑制BxPC-3細(xì)胞增殖,且具有時(shí)間及劑量依賴性(P<0.05);Gardiquimod誘導(dǎo)胰腺癌BxPC-3細(xì)胞凋亡,且具有時(shí)間依賴性(P<0.05);Gardiquimod能夠抑制胰腺癌BxPC-3細(xì)胞遷移,6天后傷痕愈合度僅達(dá)到60%,且具有時(shí)間依賴性依賴性(P<0.01)。機(jī)制研究發(fā)現(xiàn):通過(guò)western-blotting的方法來(lái)分析,TLR7受體激動(dòng)劑Gardiquimod能夠降低cyclin B1、cyclin E和Bcl-2,同時(shí),Gardiquimod能夠上調(diào)Bax,6h后可出現(xiàn)明顯升高。
結(jié)論：TLR7受體在人原位胰腺腺癌Bx PC-3細(xì)胞存在表達(dá);TLR7激動(dòng)劑Gardiquimod能夠抑制胰腺癌BxPC-3細(xì)胞的增殖、遷移和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。Gardiquimod對(duì)胰腺癌BxPC-3細(xì)胞增殖抑制及細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)可能依賴細(xì)胞周期蛋白cyclin B1、cyclin E、Bcl-2及Bax的調(diào)控。
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