一、背景
兔氣管上皮細(xì)胞是一種常用的實(shí)驗(yàn)細(xì)胞，可以用于研究呼吸系統(tǒng)疾病和藥物篩選等。這些細(xì)胞來源于兔子的氣管組織，具有與體內(nèi)組織相似的形態(tài)結(jié)構(gòu)和功能活動(dòng)，因此被廣泛應(yīng)用于基礎(chǔ)和臨床研究。
兔氣管上皮細(xì)胞具有多種特點(diǎn)，例如可以作為氣道與外界環(huán)境接觸的第一道防線，合成和釋放多種炎性介質(zhì)和細(xì)胞因子參與氣道炎癥及免疫反應(yīng)。此外，這些細(xì)胞還可以用于研究氣道修復(fù)和再生等方面的機(jī)制。
在分離和培養(yǎng)兔氣管上皮細(xì)胞時(shí)，通常采用鏈霉蛋白酶-中性蛋白酶混合消化法結(jié)合差速貼壁法等方法，以獲得純度和活性較高的細(xì)胞。此外，對(duì)于細(xì)胞的檢測(cè)和鑒定也是非常重要的一步，可以通過免疫熒光等方法來確認(rèn)細(xì)胞的身份和純度。
二、兔氣管上皮細(xì)胞培養(yǎng)步驟
1、兔氣管上皮細(xì)胞培養(yǎng)基及培養(yǎng)凍存條件準(zhǔn)備：
1)準(zhǔn)備：DMEM+10%FBS+1%P/S
2)培養(yǎng)條件：氣相：空氣，95%；二氧化碳，5%。溫度：37攝氏度，培養(yǎng)箱濕度為70%-80%。
3)凍存液：50%basal medium+40%FBS+10%DMSO。
2、兔氣管上皮細(xì)胞處理：
1）復(fù)蘇細(xì)胞：將含有1mL細(xì)胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加入4mL培養(yǎng)基混合均勻。在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，補(bǔ)加1-2mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細(xì)胞懸液加入培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜（或?qū)⒓?xì)胞懸液加入250px皿中，加入約8ml培養(yǎng)基，培養(yǎng)過夜）。第二天換液并檢查細(xì)胞密度。
2）細(xì)胞傳代：如果細(xì)胞密度達(dá)80%-90%，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。
對(duì)于貼壁細(xì)胞，傳代可參考以下方法：
1.棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤(rùn)洗細(xì)胞1-2次。
2.加2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中，置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘，然后在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，若細(xì)胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺(tái)，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加少量培養(yǎng)基終止消化。
3.按6-8ml/瓶補(bǔ)加培養(yǎng)基，輕輕打勻后吸出，在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，補(bǔ)加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻。
4.將細(xì)胞懸液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中。
注：次傳代推薦傳代比例為1:2，以后傳代比例可根據(jù)客戶需要自己決定。
3）兔氣管上皮細(xì)胞凍存：待細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好時(shí)，可進(jìn)行細(xì)胞凍存。
三、應(yīng)用
兔氣管上皮細(xì)胞可以用于兔氣管黏膜上皮細(xì)胞原代培養(yǎng)的研究：
擬建立氣管黏膜上皮細(xì)胞原代培養(yǎng)模型,觀察細(xì)胞在體外生長(zhǎng)及傳代的規(guī)律,為組織工程氣管假體的上皮化提供技術(shù)支持。
方法：
1、兔氣管上皮細(xì)胞分離培養(yǎng)：(1)從4月齡新西蘭大耳兔取出氣管(甲狀軟骨至氣管分叉),剔除氣管周圍纖維結(jié)締組織,沖洗氣管至蒼白并且無黏液為止。(2)剪開氣管、撕取黏膜,將黏膜置于含有抗生素的PBS液中浸泡除菌。(3)將黏膜剪成約1m×1mm大小的小塊。(4)將黏膜組織小塊移入培養(yǎng)瓶中,置入培養(yǎng)箱培養(yǎng)。(5)對(duì)培養(yǎng)的細(xì)胞采用刮除法結(jié)合消化排除法純化。
2、兔氣管上皮細(xì)胞細(xì)胞鑒定：對(duì)純化后的細(xì)胞通過SABC法免疫組化鑒定、FITC標(biāo)記的熒光抗體免疫熒光鑒定。
3、兔氣管上皮細(xì)胞傳代與凍存：(1)對(duì)純化的細(xì)胞進(jìn)行傳代研究,并觀察細(xì)胞在體外的生長(zhǎng)規(guī)律。(2)對(duì)純化后的細(xì)胞進(jìn)行凍存與復(fù)蘇的研究。
結(jié)果：
1、細(xì)胞培養(yǎng)：(1)培養(yǎng)約5-6d可見組織塊邊緣少量上皮樣細(xì)胞爬出。此后,組織塊周圍上皮樣細(xì)胞覆蓋面積逐漸增大,細(xì)胞呈現(xiàn)三角形、梭形、圓形、多角形、不規(guī)則形等。高倍鏡下可見部分細(xì)胞頂面伸出纖毛,在培養(yǎng)液中不斷擺動(dòng)。10d后去除組織塊,14-15d時(shí),細(xì)胞基本長(zhǎng)滿瓶壁,有纖毛的細(xì)胞無增殖。(2)通過刮除法結(jié)合消化排除法純化后的細(xì)胞純度較高。
2、兔氣管上皮細(xì)胞鑒定：(1)SABC法染色檢測(cè)細(xì)胞中角蛋白,胞質(zhì)棕黃色,胞核淡藍(lán)色,結(jié)果表明分離培養(yǎng)的細(xì)胞為上皮細(xì)胞。(2)FITC標(biāo)記的熒光抗體檢測(cè)細(xì)胞中的角蛋白,胞質(zhì)亮綠色,可見整個(gè)細(xì)胞形態(tài),表明分離培養(yǎng)的細(xì)胞為上皮細(xì)胞。
3、兔氣管上皮細(xì)胞傳代與凍存：(1)細(xì)胞可以連續(xù)傳代至第5代,傳代后細(xì)胞貼壁及生長(zhǎng)良好,細(xì)胞隨著代數(shù)的增加細(xì)胞體積逐漸變大。傳代后未見有纖毛的細(xì)胞。第2-4代細(xì)胞貼壁及生長(zhǎng)時(shí)問無明顯差異,第5代細(xì)胞貼壁數(shù)量明顯減少,生長(zhǎng)緩慢,細(xì)胞體積與前幾代相比明顯變大。(2)本實(shí)驗(yàn)復(fù)蘇凍存3個(gè)月的細(xì)胞,復(fù)蘇后細(xì)胞存活率、貼壁率較高。經(jīng)過本方法凍存與復(fù)蘇的細(xì)胞,經(jīng)過體外培養(yǎng),細(xì)胞活性、增殖能力仍然能夠恢復(fù)到凍存前水平。
結(jié)論：本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用組織塊法成功構(gòu)建出一種較為經(jīng)濟(jì)、便捷、可傳代、可重復(fù)的兔氣管黏膜上皮細(xì)胞的原代培養(yǎng)模型。成功對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行鑒定、傳代與凍存的研究,為氣管黏膜上皮細(xì)胞培養(yǎng)提供了技術(shù)可行性,為組織工程人工氣管的上皮化提供理論基礎(chǔ)與技術(shù)支持。
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