一、背景
人急性淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞是人T細(xì)胞白血病細(xì)胞株CCRF-CEM具有喜樹堿抗性的衍生株。1991年細(xì)胞株選擇并亞克隆了對CPT的抗性。細(xì)胞表現(xiàn)出對CPT類似物水溶性的托泊替康和非水溶性的9-氨基-CPT及10,11-亞甲二氧基-CPT具有交叉抗性。CEM/C1細(xì)胞對CPT的敏感性較母系CEM細(xì)胞低31倍。CEM/C1細(xì)胞表現(xiàn)非典型的多藥抗性和轉(zhuǎn)換拓補異構(gòu)酶I催化活性。對CPT的抗性維持6個月以上。
二、人急性淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞復(fù)蘇、傳代及凍存流程參考
1、人急性淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞復(fù)蘇
1）配制完全培養(yǎng)基：基礎(chǔ)培養(yǎng)基+胎牛血清+雙抗（特殊培養(yǎng)基特殊配置）；
2）細(xì)胞復(fù)蘇：取5ml完全培養(yǎng)基于15ml離心管中，37℃水浴鍋預(yù)熱，從液氮管（或者-80度冰箱）中快速取出凍存的細(xì)胞，放入37℃水浴鍋中，搖晃使快速化凍（1min左右），然后將化凍的細(xì)胞和預(yù)熱的培養(yǎng)基，移入超凈工作臺中，化凍的細(xì)胞加入到含預(yù)熱培養(yǎng)基的15ml離心管中，1000rpm離心5min；
3）吸棄上清，得到細(xì)胞沉淀，用2ml完全培養(yǎng)基輕輕重懸細(xì)胞，加入到T25培養(yǎng)瓶中，做好標(biāo)記，放入37℃，5%CO2飽和適度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)（培養(yǎng)皿復(fù)蘇效果更好）；
4）24h后，觀察細(xì)胞貼壁情況（未貼壁的即為死細(xì)胞--針對貼壁細(xì)胞），吸棄舊培養(yǎng)基，加入新鮮的預(yù)熱（室溫或37℃）的完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)。
2、人急性淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞傳代
1）待細(xì)胞生長到80%-90%匯合度時，吸棄舊的培養(yǎng)基，加入1ml無菌PBS潤洗一次，以去除殘余的培養(yǎng)基及血清（血清含有胰酶的抑制因子），然后加入1ml 0.25%胰酶，37℃培養(yǎng)箱中消化（1~2min左右，不同細(xì)胞消化時間不同），取出細(xì)胞，鏡下觀察細(xì)胞至細(xì)胞皺縮變圓；
2）加入1ml完全培養(yǎng)基（含F(xiàn)BS）終止消化，輕輕拍打，使細(xì)胞脫落下來成單個細(xì)胞懸液，收集細(xì)胞于15ml無菌離心管中，1000rpm，離心5min；
3）收集細(xì)胞沉淀，完全培養(yǎng)基重懸，一分為二（可根據(jù)細(xì)胞生長速度調(diào)整比例），分別加入到2個新的培養(yǎng)瓶中，做好標(biāo)記，放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
3、人急性淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞凍存
1）按照細(xì)胞傳代方法，在超凈工作臺內(nèi)消化收集細(xì)胞沉淀，取少量細(xì)胞用于計數(shù)；
2）用預(yù)冷的1ml凍存液（90%完全培養(yǎng)基+10%DMSO）或者無血清細(xì)胞凍存液重懸細(xì)胞，加入到1.2ml凍存管中，密度為1*106個/ml。
3）放入程序凍存盒，-80℃過夜后，轉(zhuǎn)入液氮長期保存。
三、應(yīng)用
人急性淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞可以用于紅景天苷增強急性淋巴細(xì)胞白血病CEM-C1耐藥細(xì)胞對地塞米松敏感性的研究：
探討SAL對人T-ALL細(xì)胞系CEM-C7和CEM-C1細(xì)胞增值、凋亡和自噬的影響及其是否可以增強GC耐藥CEM-C1細(xì)胞對地塞米松(Dexamethasone,DEX)的敏感性,為克服白血病細(xì)胞耐藥提供新的治療策略。
方法：
1、細(xì)胞培養(yǎng):通過體外細(xì)胞培養(yǎng)人T-ALL細(xì)胞系CEM-C7和CEM-C1細(xì)胞。2.實驗分組:
(1)根據(jù)SAL的干預(yù)濃度(5.0 mg/ml、7.5 mg/ml、10.0mg/ml、12.5 mg/ml和15.0 mg/ml)將CEM-C7和CEM-C1細(xì)胞分別分為5組;
(2)根據(jù)DEX的干預(yù)濃度(25μg/ml、50μg/ml、100μg/ml、150μg/ml和200μg/ml)將CEM-C7、CEM-C1細(xì)胞分別分為5組;以及DEX不同濃度(25μg/ml、50μg/ml、100μg/ml、150μg/ml和200μg/ml)聯(lián)合SAL(1.5 mg/ml)將CEM-C7和CEM-C1細(xì)胞分別分為5組;
(3)根據(jù)T-ALL細(xì)胞系CEM-C7與耐藥細(xì)胞系CEM-C1是否經(jīng)SAL優(yōu)化濃度(0 mg/ml、5.0 mg/ml、7.5mg/ml、10.0 mg/ml)處理分別分為4組;
(4)CEM-C1細(xì)胞根據(jù)SAL是否聯(lián)合DEX分為對照組、SAL組(1.5 mg/ml)、DEX組(100μg/ml)、聯(lián)合組(DEX 100μg/ml+SAL 1.5mg/ml)。
2、CCK-8(Cell counting kit-8):
(1)檢測不同濃度的SAL處理24h、48h、72h后CEM-C7、CEM-C1細(xì)胞的增殖活性影響;
(2)檢測不同濃度的DEX干預(yù)以及不同濃度的DEX聯(lián)合SAL作用后,各組細(xì)胞的增殖活性影響;
(3)同時確定SAL對CEM-C7、CEM-C1細(xì)胞的IC50,并計算出耐藥倍數(shù)、逆轉(zhuǎn)耐藥倍數(shù)和相對逆轉(zhuǎn)率。
3、細(xì)胞凋亡:通過流式細(xì)胞儀檢測不同濃度(0 mg/ml、5.0 mg/ml、7.5mg/ml、10.0 mg/ml)SAL干預(yù)48h后CEM-C1和CEM-C7細(xì)胞凋亡情況;以及SAL是否聯(lián)合DEX處理CEM-C1細(xì)胞后各組細(xì)胞凋亡情況。
4、細(xì)胞周期:通過流式檢測不同濃度(0 mg/ml、5.0 mg/ml、7.5 mg/ml、10.0 mg/ml)SAL干預(yù)CEM-C7和CEM-C1細(xì)胞48h后周期的改變。
5、實時熒光定量PCR:檢測不同濃度(0 mg/ml、5.0 mg/ml、7.5 mg/ml、10.0 mg/ml)SAL干預(yù)CEM-C7和CEM-C1細(xì)胞48h后后C-MYC和LC3m RNA的表達(dá)情況。
6、吖啶橙染色:檢測不同濃度(0 mg/ml、5.0 mg/ml、7.5 mg/ml、10.0 mg/ml)SAL干預(yù)48h后CEM-C7和CEM-C1細(xì)胞自噬的情況。
7、Western Blot:
(1)檢測CEM-C7和CEM-C1細(xì)胞中C-MYC蛋白的表達(dá)變化;
(2)檢測不同濃度(0 mg/ml、5.0 mg/ml、7.5 mg/ml、10.0 mg/ml)SAL處理CEM-C7和CEM-C1細(xì)胞48h后,自噬蛋白、凋亡蛋白和C-MYC蛋白表達(dá)變化;
(3)檢測SAL是否聯(lián)合DEX處理CEM-C1細(xì)胞后,各組細(xì)胞自噬蛋白、凋亡蛋白和C-MYC蛋白表達(dá)情況。
結(jié)果：
1、SAL抑制T-ALL細(xì)胞增殖:(1)SAL呈劑量依賴方式抑制CEM-C7、CEM-C1細(xì)胞增殖;(2)SAL對CEM-C7和CEM-C1細(xì)胞的48h IC50分別是8.03mg/ml和6.69 mg/ml。
2、SAL促進T-ALL細(xì)胞的凋亡:(1)流式細(xì)胞儀檢測發(fā)現(xiàn)隨著SAL濃度的增加,凋亡率顯著增加(P<0.001);(2)SAL能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,同時伴有BCL-2蛋白的下調(diào)以及Cleaved-PARP蛋白和Bax蛋白的上調(diào)(P<0.01);(3)與單用DEX組比較,聯(lián)合組(SAL+DEX)能夠更顯著地誘導(dǎo)GC耐藥CEM-C1細(xì)胞凋亡(P<0.01)。
3、SAL將CEM-C7細(xì)胞阻滯于S期(P<0.01),而對CEM-C1細(xì)胞周期無影響(P>0.05)。
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